链霉亲和素嵌入金属有机框架的无创基因检测技术用于幽门螺杆菌感染诊断

本文创新性地构建了基于CRISPR/Cas的多模块生物分子机器，通过整合5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）糖基化触发的回文引物超支化滚环扩增（PP-HRCA）技术，实现了β-葡萄糖基转移酶（β-GT）活性的超灵敏检测（检测限2.75×10-6 U/mL）。该技术融合β-GT催化保护模块、CRISPR系统介导的切割模块等创新设计，为表观遗传学研究提供了新工具。

　　

【研究亮点】

我们构建了结构有序的多模块CRISPR生物分子机器，通过5-hmC糖基化触发的回文引物超支化滚环扩增（PP-HRCA）实现外源性β-GT活性的超灵敏分析。该机器整合了三大功能模块：β-GT催化保护模块（通过糖基化反应保护哑铃探针免受MspI内切酶消化）、回文引物扩增模块（触发高效PP-HRCA产生大量双链DNA产物）、CRISPR系统切割模块（激活Cas蛋白反式切割信号探针释放Cy5荧光分子）。

【实验方法】

β-GT活性检测在10μL体系中进行，包含梯度浓度β-GT、100 nM哑铃探针、120 μM UDP-葡萄糖和1×NEBuffer 4。37℃反应60分钟后，加入MspI内切酶消化未保护的DNA。完整的哑铃探针随后引发PP-HRCA，扩增产物激活CRISPR/Cas12a切割信号探针，通过荧光光谱和单分子成像定量Cy5信号。

【结论】

该生物分子机器具有2.75×10^-6 U/mL的超高灵敏度，线性范围跨越七个数量级。不仅能精准检测复杂生物样本中的β-GT活性，还可用于酶动力学参数分析和抑制剂筛选，为研究DNA修饰机制和宿主-病原体相互作用提供了强大平台。