热干燥法合成密度可调高稳定性非硫醇化球形核酸用于裂解适配体与侧向流生物传感器的研究

为解决高密度DNA探针在生物传感器应用中存在的空间位阻问题，研究人员通过热干燥法制备了密度可调的非硫醇化球形核酸（SNAs），并系统研究了其在适配体识别和杂交检测模式中的功能特性。通过引入短稀释链调控探针密度，实现了对氧四环素（0.5 μM检测限）和转基因大豆MON87705（0.08 wt%检测限）的高灵敏度检测。该研究为低成本SNAs探针的设计与应用提供了重要指导，推动了便携式生物传感器的发展。

　　

在生物传感领域，球形核酸（Spherical Nucleic Acids, SNAs）因其独特的结构和功能特性备受关注。传统SNAs依赖硫醇化DNA通过金-硫键固定在金纳米颗粒（AuNPs）上，但高昂的合成成本限制了其广泛应用。近年来，非硫醇化DNA（尤其是含多聚腺嘌呤片段）的吸附策略虽能降低成本，却面临DNA密度调控困难、制备周期长（如盐老化法需40小时）等问题。更关键的是，高密度DNA可能导致空间位阻，阻碍适配体与靶标结合，而低密度又会影响探针稳定性——这一矛盾成为开发高效SNAs生物传感器的核心挑战。

针对上述问题，中国农业大学食品质量与安全北京实验室的研究团队创新性地采用热干燥法，成功制备出密度可调、稳定性媲美硫醇化SNAs的非硫醇化探针。通过系统研究其在适配体识别（以氧四环素为模型）和杂交检测（以转基因大豆为靶标）两种模式中的性能，提出了针对性的优化策略。相关成果发表在《Biosensors and Bioelectronics》上，为低成本SNAs探针的实用化提供了重要技术支撑。

研究团队运用了三大关键技术：1）热干燥法制备高密度非硫醇化SNAs，通过末端腺嘌呤吸附实现快速（相比盐老化法）且稳定的DNA负载；2）引入短链A₃T₂作为稀释DNA，在不影响整体稳定性的前提下精准调控功能DNA密度；3）整合环介导等温扩增（LAMP）与CRISPR/Cas12a系统，结合侧向流检测（LFA）实现转基因作物的便携式高灵敏度检测。

3.1 靶标分子与连接DNA的竞争机制

研究发现，采用13 nm和30 nm AuNPs构建的SNAs在氧四环素（OTC）存在时均无法引发聚集，而互补连接DNA可成功诱导组装。通过荧光标记实验证实，高密度DNA（每个AuNPs负载约200条链）产生的空间位阻会阻碍OTC与裂解适配体的结合，这种效应源于适配体结合口袋（>2 nm）大于标准DNA双链直径。

3.2 DNA密度的精准调控

创新性地采用A₃T₂短链作为稀释剂，在总DNA与AuNPs比例恒定（200:1）条件下，将功能DNA（FAM-DNA1）密度降低64%。热稳定性实验表明，即使100°C加热15分钟或在竞争DNA存在下，SNAs仍能保持DNA负载，证实了热干燥法制备探针的优异稳定性。

3.3 裂解适配体比色传感器的构建

通过优化适配体茎区互补碱基对数量（4bp时最佳），解决了SNAs自发杂交导致的假阳性问题。最终构建的传感器对OTC检测限达0.5 μM，且对其他抗生素无交叉反应，验证了裂解适配体策略的特异性。

3.4 LFA探针的关键参数优化

发现膜固定DNA中引入poly-T₅间隔可消除poly-A₁₀导致的假阳性信号。值得注意的是，仅需4个连续互补碱基即可触发可见检测线信号，这对LFA设计中的序列筛选具有重要指导意义。

3.5 转基因大豆MON87705的便携检测

将LAMP-CRISPR/Cas12a系统与SNAs-LFA平台整合，实现对转基因大豆的灵敏检测（0.08 wt%），优于中国国家标准（0.1 wt%）。该平台通过Cas12a的反式切割活性放大信号，使低浓度样本也能产生明显的检测线条带。

这项研究的意义在于：首先，热干燥法突破了非硫醇化SNAs制备的技术瓶颈，其快速（相比盐老化法）、低成本的优势有利于规模化生产；其次，提出的DNA密度调控策略解决了高密度探针在适配体识别中的空间位阻问题，为不同应用场景的SNAs设计提供了普适性方案；最后，在转基因检测中展示的LAMP-CRISPR-LFA集成平台，为现场快速检测提供了可推广的技术范式。这些成果不仅推动了SNAs基础研究的深化，更为食品安全监测、病原体诊断等领域的便携式设备开发奠定了技术基础。