基于多西环素诱导表达系统的局部癌症免疫治疗活性转基因组合的临床前鉴定模型

这篇研究创新性地构建了多西环素（dox）诱导的Tet-on慢病毒表达系统，结合流式细胞术（FACS）和多重免疫组化（mIHC）技术，建立了可快速筛选免疫调节转基因组合的临床前模型。通过在肝癌（Hep55.1c）和结肠癌（MC38）小鼠模型中验证，发现靶向树突状细胞（DC）和T细胞的IL-12/CXCL9/FLT3L三联组合可显著增强肿瘤微环境（TME）免疫应答，诱导完全缓解，为实体瘤局部免疫治疗提供了新策略。

　　

引言

系统性免疫治疗在低免疫原性肿瘤中疗效受限，这类肿瘤通过抑制T细胞启动和浸润逃避免疫监视。病毒载体和mRNA/脂质纳米颗粒（LNP）等现代抗原递送技术的出现，使得同时表达多个转基因的局部免疫治疗成为可能。然而，缺乏快速评估转基因组合的临床前模型阻碍了治疗性组合的发现。研究团队开发了基于多西环素（dox）诱导的Tet-on系统，结合流式细胞术（FACS）和多重免疫组化（mIHC）成像技术，为实体瘤局部免疫治疗提供了高效筛选平台。

Tet-on表达系统的建立与验证

该系统由rtTA3转录激活因子和TRE_tight启动子构成，在dox存在时可高效诱导转基因表达。体外实验显示，EGFP表达在24小时内达到峰值，撤药后逐渐衰减；体内实验证实，MC38和Hep55.1c移植瘤中EGFP表达严格依赖dox饮食，12天达峰，停药4天后恢复基线。这种可控性为后续免疫调节研究奠定了基础。

单转基因的免疫调节特性

研究筛选了靶向DC（XCL-1、FLT3L、CD40L）、T细胞（CXCL9）或双靶向（IL-12、CCL4）的转基因。结果显示：

1. IL-12显著增加CD8⁺T细胞颗粒度，但降低肿瘤内DC频率；

2. FLT3L系统性扩增DC，但在MC38模型中抑制B/NK细胞，在Hep55.1c中仅减少MDSC；

3. CXCL9促进CXCR3⁺T细胞募集；

4. CD47 shRNA通过阻断"别吃我"信号增强吞噬作用。

   值得注意的是，单转基因疗效有限且具有肿瘤类型依赖性，提示组合策略的必要性。

转基因与检查点抑制的协同效应

在PD-1抑制剂联用实验中：

• CD40L/PD-1组未见显著协同效应；

• CXCL9/PD-1显著降低肿瘤内巨噬细胞和T细胞频率；

• FLT3L-Mip1α/PD-1展现出最强的协同作用，显著增加肿瘤特异性CD8⁺T细胞并抑制肿瘤生长。

  结果表明，PD-1抑制剂的疗效优势可能掩盖部分转基因作用，但特定组合（如FLT3L-Mip1α）能产生"1+1>2"效应。

双转基因组合的优化

通过混合表达不同转基因的肿瘤细胞（1:1比例），发现：

• FLT3L/XCL1维持DC扩增但未增强疗效；

• FLT3L/CD40L虽提高DC数量，但未显著激活CD86表达；

• IL-12/CXCL9最具潜力：不仅逆转IL-12导致的DC减少，还增加CD86⁺活化DC和颗粒酶B⁺CD8⁺T细胞，肿瘤体积缩小47.3%。空间分析显示，该组合促进DC与T细胞在肿瘤核心区的共定位。

三联组合的突破性疗效

IL-12/CXCL9/FLT3L组合实现：

1. 免疫细胞重编程：肿瘤内DC增加2.1倍，CD8⁺T细胞上升1.8倍，巨噬细胞减少60%；

2. 空间重构：mIHC显示CD103⁺DC与CD8⁺T细胞最小距离缩短至15μm；

3. 完全缓解：所有治疗组小鼠肿瘤完全消退，再挑战实验证实产生免疫记忆。

   该组合通过同时激活DC（FLT3L扩增、IL-12活化）和T细胞（IL-12激活、CXCL9招募），形成正向免疫循环。

讨论与展望

该研究建立的Tet-on筛选平台具有三大优势：

1. 可快速评估>10种转基因组合；

2. 通过FACS/mIHC多维度解析TME动态；

3. 鉴定出IL-12/CXCL9/FLT3L这一可转化方案。局限性在于尚未在自发肿瘤模型和人体组织中验证。未来可探索该三联组合在溶瘤病毒或LNP/mRNA载体中的应用，尤其适用于肝动脉灌注治疗肝癌。

材料与方法亮点

• 载体设计：Gateway重组系统实现无酶克隆，rtTA3/TRE_tight保证低本底泄漏；

• 免疫分析：7色流式panel覆盖DC/T细胞/巨噬细胞亚群，6色mIHC解析空间互作；

• 模型选择：MC38（高免疫原性）与Hep55.1c（低免疫原性）形成互补验证。

这项研究为实体瘤局部免疫治疗提供了从机制探索到临床转化的完整研究范式。