副溶血弧菌LPS通过介导宿主免疫逃逸在感染中发挥关键作用

这篇研究揭示了副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, V. para）通过脂多糖（LPS）的独特脂质A结构（hexa/hepta-acylated）逃逸宿主免疫识别的分子机制。研究发现，胞外菌合成七酰化脂质A（m/z 1950.35/1976.36）抑制Toll样受体4（TLR4）激活，而胞内菌转为六酰化结构（m/z 1740.15）。敲除次级酰基转移酶基因lpxM（VP0213）导致脂质A结构改变，增强TLR4响应并削弱上皮细胞内复制能力，为靶向LPS的抗菌策略提供新思路。

　　

副溶血弧菌LPS介导免疫逃逸的分子机制

脂质A结构的独特性

副溶血弧菌（V. para）作为革兰阴性嗜盐菌，其脂多糖（LPS）的脂质A组分呈现温度非依赖性异质性。通过快速脂质分析技术（FLAT）和串联质谱（FLATⁿ）鉴定，胞外菌主要合成七酰化脂质A（含C14或C16:1次级酰基链，m/z 1950.35/1976.36），同时存在少量六酰化形式（m/z 1740.15）。气相色谱（GC-FID）显示25°C时C12和C16:1酰基链占比更高。值得注意的是，所有测试菌株（包括环境株A2和急性肝胰腺坏死病株D4）均保守此结构特征，且与霍乱弧菌（V. cholerae）脂质A的差异仅在于3′位次级酰基链羟基化修饰的缺失。

胞内菌的脂质A重塑

利用荧光激活细胞分选（FACS）分离感染Caco-2细胞的细菌，发现胞内菌仅保留六酰化脂质A（m/z 1740.15），而七酰化形式消失。同位素峰验证（M+1/M+2）确认该结构为宿主内特异性重塑，暗示细菌通过下调七酰化修饰适应胞内环境。

LpxM的功能解析

生物信息学筛选锁定VP0213为潜在次级酰基转移酶（LpxM）。敲除lpxM的CAB2ΔlpxM突变株产生五酰化（m/z 1558）和六酰化（m/z 1769/1795）脂质A，缺失3′位C12酰基链。互补实验（pBAD-lpxM）可恢复野生型结构，证实LpxM特异性催化3′位酰化，而非类似鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的双重酰基转移活性。突变株在正常培养中形态正常，但多黏菌素应激下出现丝状表型，揭示膜完整性缺陷。

免疫识别与逃逸的分子基础

结构建模显示，七酰化脂质A的C2位额外酰基链会阻碍TLR4/MD-2二聚化界面（橙色圆圈），而六酰化结构（如CAB2ΔlpxM产物）则更有效激活TLR4。实验证实：

• 野生型CAB2 LPS激活人/鼠TLR4的半数有效浓度（EC₅₀）比大肠杆菌（E. coli）高8倍（35.06 vs. 4.23 ng/mL）；

• CAB2ΔlpxM LPS的EC₅₀显著降低（9.24 ng/mL），TLR4响应增强；

• 竞争性结合实验显示CAB2ΔlpxM LPS优先结合TLR4。

胞内生存的致命缺陷

尽管CAB2ΔlpxM能正常分泌T3SS2效应蛋白（VopA/VopL）并侵入细胞，但：

1. 侵入后1小时即出现存活率下降，3小时后被宿主清除；

2. 胞内菌形成应激性丝状体（长度增加2-3倍），5小时后分裂停滞；

3. 早期内体标志物EEA1染色证实突变菌能逃逸至胞质，排除内体滞留因素；

4. Caspase-4敲除细胞中仍无法存活，提示清除机制不依赖焦亡通路。

临床与治疗意义

该研究首次揭示V. para通过脂质A动态修饰实现"胞外隐身-胞内适应"的双重策略：七酰化结构规避TLR4监视，而六酰化形式维持胞内复制。LpxM缺失导致的免疫暴露和复制缺陷，为针对LPS结构的抗菌剂开发（如酰基转移酶抑制剂）提供靶点。此外，比较其他病原体（如鼠疫耶尔森菌的PagP系统）的脂质A修饰机制，凸显Vibrio属进化出独特的免疫逃逸途径。

（注：全文数据均基于FLAT/MS、GC-FID、报告基因实验等原始结果，未引用图示和文献标识）