冬油菜抗冻蛋白基因BrAFP2的低温调控机制及其在抗寒育种中的应用价值

本研究针对中国北方冬季严寒导致冬油菜种植受限的问题，从强抗寒品种陇油7号中分离出具有冰晶重塑活性的抗冻蛋白BrAFP2（属类甜蛋白TLP家族）。通过克隆8个品种的BrAFP2基因及9个品种的启动子，发现其核心调控区（-879至-453 bp）含低温响应元件LTR。转基因拟南芥证实BrAFP2通过抑制ROS积累（H2O2/O2-）提升抗冻性，且与谷胱甘肽-S-转移酶BrGST互作维持蛋白活性。该成果为冬油菜抗寒分子育种提供新靶点。

　　

在北方凛冽的寒冬中，冬油菜的生存面临严峻挑战。当温度跌破-18℃时，普通品种难以越冬，而中国北方广袤的休耕土地却蕴藏着巨大的种植潜力。如何培育出更强抗寒性的冬油菜品种，成为农业科学家亟待解决的难题。这其中，抗冻蛋白（Antifreeze Proteins, AFPs）的作用尤为关键——它们能抑制冰晶重结晶，防止细胞被尖锐的冰晶刺破，堪称植物的"防冻液"。

甘肃农业大学干旱生境作物学国家重点实验室的研究团队将目光投向了抗寒能力惊人的陇油7号冬油菜，该品种能在-30℃极端低温下存活长达一周。研究人员通过冰亲和吸附法从低温处理的叶片中分离出一种能改变冰晶形态的蛋白质，质谱鉴定显示这是一种25.4 kDa的类甜蛋白（Thaumatin-like Protein, TLP），被命名为BrAFP2。这项揭示冬油菜抗冻分子机制的研究成果发表在《Industrial Crops and Products》上。

研究采用多维技术手段：通过双向电泳（2-DE）和质谱鉴定差异表达蛋白；利用冷显微平台观察冰晶形态；克隆8个品种的BrAFP2编码序列及9个品种的启动子；构建35S::BrAFP2转基因拟南芥进行功能验证；采用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶（LUC）报告系统验证蛋白互作。

研究结果揭示：

1. BrAFP2的鉴定与功能

   双向电泳发现低温诱导的10个差异蛋白点，其中Spot 13经质谱鉴定为TLP。冷显微观察显示，BrAFP2能使冰晶呈现规则形态，而对照组冰晶呈不规则杆状（图1）。

2. 基因克隆与变异分析

   从8个品种中克隆的BrAFP2基因均长696 bp，存在9个SNP，其中2个错义突变导致第100位（谷氨酰胺/谷氨酸）和第206位（酪氨酸/苯丙氨酸）氨基酸变异（图S1）。强抗寒品种在第100位均为谷氨酰胺。

3. 表达模式特征

   qRT-PCR显示BrAFP2在-4℃处理24 h后表达量达峰值，在叶片中表达量比根高3倍（图2）。启动子驱动GUS报告基因在转基因拟南芥叶片、花萼和角果皮中特异性表达，而在根和花中无活性（图3）。

4. 启动子核心区域

   缺失片段实验确定-879至-453 bp区段为启动子核心区域，包含LTR低温响应元件（图4）。该启动子仅在低温下激活，室温无活性。

5. 抗寒功能验证

   过表达BrAFP2的拟南芥在-4℃处理后存活率显著高于野生型和afp2突变体（图5A）。生理指标显示转基因株系H₂O₂含量降低40%，相对电解质渗漏率（REL）减少35%（图5F-G），NBT/DAB染色显示ROS积累显著减少（图5H-I）。

6. 蛋白互作机制

   Y2H筛选发现BrAFP2与谷胱甘肽-S-转移酶（BrGST）相互作用，BiFC和LUC实验证实二者在细胞质和细胞核中共定位（图6-7）。推测BrGST通过清除ROS维持BrAFP2的抗冻活性。

这项研究首次系统解析了冬油菜BrAFP2的抗冻分子机制：低温诱导启动子激活→BrAFP2表达→抑制冰晶重结晶→与BrGST协同降低氧化损伤。其中第100位谷氨酰胺的保守性、启动子-879至-453 bp的核心调控区、以及BrGST的"伴侣蛋白"功能，均为抗寒分子育种提供了精准靶点。该成果对开发利用北方冬季休耕土地、保障粮油安全具有重要战略意义，其发现的冷诱导特异性启动子还可用于设计环境响应型基因回路。值得一提的是，BrAFP2作为具有双重功能的TLP家族成员，可能同时参与抗病反应，这为作物多抗性育种开辟了新思路。