揭示瘟病毒非结构蛋白4B（NS4B）的膜拓扑结构及其在病毒生命周期中的多功能性机制

这篇研究通过实验方法解析了瘟病毒非结构蛋白4B（NS4B）的膜拓扑结构，结合计算预测和SCAM（半胱氨酸替换可及性分析）技术，首次提出其N端双拓扑构象（含两段跨膜域TMD2-3）及C端9个膜相关α螺旋的模型，为理解NS4B在病毒复制复合体组装和形态发生中的多功能性（如ER膜重塑、RNA合成）提供了结构基础，对阐明黄病毒科（Flaviviridae）成员的进化差异具有重要意义。

　　

摘要

瘟病毒非结构蛋白4B（NS4B）作为正链RNA病毒复制复合体的关键组分，其膜拓扑结构长期未明。研究通过实验与计算相结合的方法，首次揭示BVDV-1 NS4B形成N端两段跨膜域（TMD2-3）和C端9个α螺旋的独特构象，并发现其N端两亲性螺旋（AH1）存在类似HCV NS4B的双拓扑特征——既可定位于胞质侧，又能转位至ER腔面。这一发现为理解NS4B在病毒生命周期中的多功能性（如膜重塑、复制复合体组装）提供了结构基础。

引言

瘟病毒（如BVDV、CSFV）与丙型肝炎病毒（HCV）同属黄病毒科，其NS4B在病毒RNA复制和颗粒组装中发挥核心作用，但具体机制尚不清晰。已知HCV NS4B通过多跨膜域和两亲性螺旋诱导内质网（ER）膜形成“膜网结构”（MW），而瘟病毒NS4B的膜拓扑及其功能关联仍属空白。研究旨在填补这一空白，为比较病毒学提供新视角。

材料与方法

序列分析与结构预测

通过ClustalX2对9种瘟病毒NS4B序列比对显示，C端保守性较高（62%），N端变异显著。Proteus预测12段α螺旋，而跨膜域（TMD）工具（如DeepTMHMM、TOPCONS）结果不一，提示需实验验证。

SCAM技术

利用半胱氨酸替换（共构建54个突变体）结合聚乙二醇-马来酰亚胺（PEG-maleimide）标记，通过Western blot检测修饰效率。结果显示：

• N端（aa 4-38）和C端（aa 339-345）可被修饰，证实其胞质定位。

• aa 51-98区域（含H2-H3）修饰阴性，提示形成TMD2-3，中间环（aa 66-82）位于ER腔面。

双拓扑验证

Split-GFP实验表明，NS4B N端GFP11标签与胞质/ER腔GFP1-10均能互补发光，证实AH1可双向定位。糖基化实验进一步显示，N端插入的EC4环（含NSS基序）能被糖基化，而C端插入则否，支持拓扑动态性。

结果

膜拓扑模型

NS4B呈现“两跨膜域+多螺旋”架构：

1. N端区：AH1（aa 1-20）具双拓扑特性；TMD2（aa 51-70）和TMD3（aa 83-98）跨ER膜，中间环（aa 71-82）腔面暴露。

2. C端区：9段α螺旋中，H4/H5/H7/H8为膜嵌入，AH6/AH10/AH12为两亲性螺旋，可能参与蛋白互作或膜弯曲。

功能关联

• 复制缺陷：C端StrepHA标签导致病毒复制效率降低100倍，提示该区域可能参与NS5A互作。

• 糖基化位点：aa 30/40插入EC4的糖基化效率高于aa 75/80，反映腔面环的膜邻近限制。

讨论

与HCV NS4B的异同

• 相似性：N端AH1双拓扑保守，可能通过寡聚化调控复制复合体组装。

• 差异：瘟病毒NS4B仅含2个TMD（HCV为4个），且C端螺旋数量显著更多，暗示功能分化。

未解问题

AH1转位是否可逆？如何调控？H4-H8的“螺旋束”是否介导宿主因子招募？这些将成后续研究重点。

意义

该研究首次绘制瘟病毒NS4B膜拓扑图谱，为靶向NS4B的抗病毒设计（如干扰AH1转位或TMD2-3寡聚化）奠定基础，同时拓宽了对黄病毒科膜蛋白进化多样性的认知。