综述：CRISPR/Cas9介导的丝状真菌基因编辑技术在食用菌与植物病原真菌中的应用

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌研究中的突破性进展，重点聚焦食用蘑菇（如裂褶菌、灰盖鬼伞）和植物病原真菌（如稻瘟病菌）的遗传改造。作者深入剖析了多核体（multi-karyosis）和异核体（heterokaryosis）等真菌特有生物学特性对基因编辑效率的挑战，详细比较了RNP（核糖核蛋白）递送与质粒表达系统的优劣，并总结了提高同源重组（HR）效率的策略（如敲除NHEJ通路基因ku70/80）。文中还特别探讨了无标记基因编辑、原生质体再生筛选等关键技术，为真菌功能基因组研究和农业应用提供了重要方法论参考。

　　

CRISPR/Cas9介导的丝状真菌基因编辑革命

挑战：多核与异核的生物学壁垒

丝状真菌独特的生长方式构成基因编辑首要障碍。菌丝顶端细胞通过连续分裂形成多核网络，其中担子菌纲的每个细胞常含两个遗传异质的核（异核体），而子囊菌则多为多核状态。这种核复杂性导致CRISPR/Cas9系统难以同步编辑所有核，非编辑核在再生过程中形成逃逸群体。最新研究通过原生质体反复再生结合抗性标记筛选（如潮霉素磷酸转移酶hph），可逐步富集单核编辑菌株。

技术突破：从质粒到RNP递送

早期依赖质粒表达Cas9和sgRNA的方法面临转化效率低、随机整合等问题。2019年里程碑式研究首次在裂褶菌中采用预组装Cas9-sgRNA RNP复合物，配合含诺尔丝菌素抗性基因（nat）的同源修复模板，实现hom₂基因高效敲除。RNP直接递送避免了外源DNA整合，编辑效率提升5-8倍。后续研究拓展至灰盖鬼伞的KEX2、cre1等基因编辑，证实RNP在担子菌中的普适性。

精准操控：从NHEJ抑制到HR增强

真菌中非同源末端连接(NHEJ)占主导的修复机制严重制约精准编辑。关键突破来自ku70/ku80/lig4等NHEJ通路基因的敲除，使灰盖鬼伞的HR效率从<1%跃升至>80%。表观调控领域则通过组蛋白去甲基化（如H3K27me3）激活靶基因区域可及性，结合CRISPRa系统实现转录因子roc1的时空特异性调控。

应用前沿：从餐桌到田间

在食用菌领域，香菇（L. edodes）的木质素降解酶编辑使生物质转化率提升40%；灵芝（G. lucidum）通过gan⁺基因簇编辑实现三萜产量翻倍。植物病原真菌方面，稻瘟病菌（M. oryzae）效应蛋白Avr-Pik^D的定向突变创制了新型抗病水稻材料，而尖孢镰刀菌（F. oxysporum）的致病相关基因FOW2敲除株显示宿主范围特异性改变。

未来方向：从单一编辑到系统重编程

新型核酸酶Cpf1（Cas12a）凭借TTN-PAM识别特性正拓展编辑范围，其粘性末端产生特性更利于大片段插入。合成生物学工具如启动子工程（采用gpdA强启动子驱动Cas9）与抗性标记循环使用策略（hph/nat交替筛选）将进一步推动多基因回路构建。随着单细胞核测序技术在异核体分型中的应用，精准编辑将迈向单核分辨率时代。