基因工程小鼠肝母细胞瘤永生细胞系的高效构建及其分子机制研究

研究人员针对肝母细胞瘤(HB)研究中缺乏分子特征明确的细胞模型这一关键问题，通过CRISPR/Cas9靶向敲除Cdkn2a抑癌基因位点，成功从过表达β-catenin(B)、YAP(Y)和NRF2(N)组合的基因工程小鼠HB中建立了11株永生细胞系。这些细胞系能稳定传代并保持原发肿瘤特性，其中10株可在免疫健全小鼠体内形成皮下和肺转移瘤。研究揭示了p16INK4A/p19ARF信号异常在HB发生中的作用，为研究肿瘤微环境、药物筛选及转移机制提供了理想模型。

　　

肝母细胞瘤(HB)作为儿童最常见的肝脏恶性肿瘤，其发病率正以惊人的速度增长。尽管70-80%的病例可通过手术和化疗治愈，但剩余患者往往面临复发、转移等困境，最终只能依赖肝移植——这种治疗方式不仅费用高昂，而且伴随终身并发症。更令人担忧的是，全球范围内HB的发病率增速已超过所有其他儿童肿瘤。这种严峻形势凸显了对新型治疗策略的迫切需求。

制约HB研究的关键瓶颈在于缺乏能真实反映肿瘤分子特征的细胞模型。目前广泛使用的人类HB细胞系HepG2源自15岁患者，不仅存在年龄偏大的局限性，更严重的是其基因组中缺乏HB典型驱动基因β-catenin(B)、YAP(Y)和NRF2(N)的突变。而近年报道的小鼠HB细胞系又过度依赖Myc致癌基因，与人类HB的分子特征相去甚远。这种模型系统的匮乏严重阻碍了针对HB特异性靶点的药物开发和机制研究。

美国匹兹堡大学医学中心儿童医院（UPMC Children's Hospital of Pittsburgh）的研究团队在《Biochemical and Biophysical Research Communications》发表的重要研究中，开创性地建立了一套分子特征明确的HB细胞模型体系。研究人员采用Sleeping Beauty转座子系统，将患者来源的β-catenin^del90(B)、YAP^S127A(Y)和NRF2^L30P(N)突变组合导入小鼠肝脏诱导HB形成，同时利用CRISPR/Cas9靶向敲除Cdkn2a抑癌基因位点（该基因编码p16^INK4A和p19^ARF两种抑癌蛋白），最终成功建立了8株BY（β-catenin+YAP）和3株BYN（β-catenin+YAP+NRF2）永生细胞系。

研究采用的关键技术包括：1）Sleeping Beauty转座子系统介导的体内基因递送；2）CRISPR/Cas9靶向基因组编辑；3）高通量DNA测序分析突变谱；4）RNA-seq转录组分析；5）三维肿瘤球体培养系统。人类HB数据来自GEO数据库的59例样本，小鼠模型则通过免疫组化、Western blot等功能实验进行验证。

主要研究结果

Cdkn2a位点在HB中的异常调控

研究发现实验性小鼠HB和人类HB中p16^INK4A/p19^ARF表达显著升高，但下游E2F和TP53靶基因却呈现与预期相反的调控模式。这表明虽然Cdkn2a通路被激活，但其生长抑制功能被B/Y/N的强致癌信号所覆盖。

永生细胞系的高效建立

通过靶向Cdkn2a exon 2或p16^INK4A特异性exon 1α，研究人员首次实现HB细胞的高效永生化。11株细胞系中有10株能在免疫健全小鼠体内形成移植瘤，其中6株还可产生肺转移灶。引人注目的是，BY1细胞系甚至表现出自发转移能力。

突变谱与功能选择

高通量测序揭示了Cdkn2a位点的复杂突变模式，包括p16^INK4A-p19^ARF融合蛋白等特殊变异。这些突变在体外培养过程中经历正负选择，部分突变体与人类肝癌中发现的融合蛋白高度相似。功能实验证实，重新表达野生型p16^INK4A或p19^ARF可强烈抑制细胞生长。

肿瘤球体的动态特性

所有细胞系均可形成三维球体，并在缺氧核心区域激活内皮细胞标志物Tie2-EGFP的表达。这种"内皮样转分化"现象在体内肿瘤血管周围同样存在，为研究肿瘤微环境提供了独特模型。

这项研究的意义在于首次建立了分子机制明确、遗传背景清晰的HB永生细胞系资源库。这些细胞系不仅保留了原发肿瘤的关键特征，更能模拟转移过程，为深入研究HB的分子机制、药物筛选和个性化治疗提供了不可多得的实验工具。特别值得注意的是，研究中发现的Cdkn2a突变谱与人类癌症高度相似，暗示这可能是一种跨癌种的共同机制。

从转化医学角度看，该研究提出的"致癌信号+抑癌基因失活"双打击模型为理解HB发生提供了新视角。而建立的人类HB细胞系构建策略，有望解决长期困扰该领域的研究材料匮乏问题。这些突破将极大加速HB靶向药物的开发进程，为改善高危患儿预后带来希望。