GenomePAM：基于哺乳动物基因组重复序列的CRISPR-Cas核酸酶PAM特征分析与工程化平台

这篇开创性研究开发了GenomePAM技术，利用基因组重复序列（Rep-1等）在哺乳动物细胞中直接表征CRISPR-Cas系统（包括SpCas9、SaCas9、FnCas12a等）的原型间隔相邻基序（PAM）偏好。该方法突破传统技术限制，无需蛋白纯化或合成寡核苷酸库，即可精准鉴定复杂PAM（如CjCas9的NNNNRYAC）及近无PAM限制的SpRY变体，同时实现单次实验对数以千计的匹配/错配位点进行全基因组水平活性与特异性评估，为新型Cas核酸酶的发现、工程化及染色质可及性研究提供了革命性工具。

　　

方法设计

人类基因组中高度重复的序列为PAM表征提供了天然资源库。研究团队筛选出重复序列Rep-1（5′-GTGAGCCACTGTGCCTGGCC-3′），该序列在二倍体细胞中出现约16,942次，其侧翼序列具有近乎随机的多样性。通过将Rep-1作为原型间隔序列设计单向导RNA（sgRNA），结合GUIDE-seq技术捕获Cas核酸酶在基因组上的切割位点，建立了GenomePAM分析流程。创新性开发的"种子扩展"算法能自动识别统计显著的富集motif，并通过GenomePAM Table直观展示编辑位点比例。

经典Cas核酸酶的PAM表征

在HEK293T细胞中，GenomePAM准确重现了SpCas9的NGG、SaCas9的NNGRRT和FnCas12a的YYN等已知PAM特征。值得注意的是，错配靶点相关的PAM中SpCas9第二位G和SaCas9第六位T的出现频率显著高于完美匹配靶点。使用不同重复序列（Rep-2等）验证结果一致，且与PAM-DOSE等传统方法数据高度相关（R=0.92-0.96）。

挑战性PAM的解析

针对长PAM需求的CjCas9，研究发现其最优PAM为NNNNRYAC，且21-22nt的间隔序列能显著提升切割效率。对于近无PAM限制的SpRY变体，GenomePAM检测到5,003个完美匹配位点和23,946个错配位点，证实其几乎不受PAM限制的特性。

新型Cas核酸酶的发现与应用

通过宏基因组分析发现的新型V-A型RuCas12a和II-A型TiCas9，经GenomePAM鉴定分别具有TTYN和NNNACT的PAM特征。在20个内源位点验证中，RuCas12a编辑效率达3.4-40.6%，TiCas9最高达30%。借助AlphaFold 3预测的蛋白-DNA相互作用，对TiCas9进行K1315Q突变工程，成功将其PAM特异性从NNNACT拓展为ANT，实现A/T富集区域的靶向能力。

Cas变体的全基因组效能评估

通过单次实验同时比较7种SpCas9变体（包括SpCas9-HF1、HypaCas9等）的数以万计切割位点，发现SpCas9-HF1具有最佳特异性（完美/错配位点比1.13），而野生型活性最高但特异性最低。测序数据量分析显示，100万reads即可稳定检测主要切割模式，为变体选择提供了量化依据。

染色质可及性图谱绘制

在HEK293T、HepG2、Huh7和HeLa细胞中的重复实验显示，肝源细胞系（HepG2/Huh7）具有相似的染色质开放特征，显著不同于HeLa细胞。以5Mb为窗口的全基因组可及性图谱，为研究组织特异性编辑效率差异提供了新视角。

这项技术突破不仅简化了CRISPR-Cas系统的表征流程，更通过"基因组即文库"的创新理念，为核酸酶工程化、脱靶评估和表观遗传研究开辟了新途径。其独特的正选择策略特别适合鉴定低限制性PAM，而全基因组尺度的数据分析能力为理解染色质环境对基因编辑的影响提供了系统解决方案。