可诱导全基因组突变策略提升大肠杆菌质粒DNA生产效能

本研究针对基因治疗和DNA疫苗生产中质粒DNA(pDNA)产量低、成本高的瓶颈问题，通过可诱导全基因组突变技术(aTc-MP6)结合荧光筛选，成功获得质粒拷贝数(PCN)显著提升的大肠杆菌NEB 5α突变株M3。该菌株对含pUC、p15A和pSC101三种复制起点的质粒均表现出增强的复制能力，其中pUC起点质粒提升最高达8.7倍。全基因组测序鉴定出85个突变位点，证实recG基因突变在协同其他突变促进pDNA合成中的关键作用。该研究为工业级pDNA生产提供了高效工程菌株，同时揭示了质粒复制的复杂调控网络。

　　

在基因治疗和DNA疫苗研发如火如荼的今天，质粒DNA(pDNA)作为关键原料却面临"卡脖子"难题——当前大肠杆菌生产体系下，每克pDNA成本高达10万美元，严重制约了临床应用。传统方法通过改造质粒载体或单个宿主基因提升产量，但受限于质粒复制复杂的多基因调控网络，效果有限。针对这一瓶颈，研究人员创新性地采用可诱导全基因组突变技术，为破解pDNA生产困境提供了新思路。

来自国内研究机构（根据通讯地址判断）的Zidan Li1团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究中，开发了基于aTc-MP6突变系统的全基因组工程策略。该系统通过诱导dam/seqA过表达破坏错配修复，4小时内即可产生平均100个基因组突变，突变谱以T:A?C:G转换为主且均匀分布全基因组。研究人员首先构建了含弱启动子J23116和弱核糖体结合位点B0032的GFP报告质粒作为PCN指示系统，通过荧光激活细胞分选(FACS)从10⁶突变体中筛选到高产菌株M3。该菌株在1L生物反应器中虽生长速率降低，但pDNA比产量提升2.3倍。全基因组测序鉴定出85个突变，通过多重自动化基因组工程(MAGE)技术验证recG R584H突变的关键协同作用——单独引入该突变不提升PCN，但在M3背景下逆转该突变会使PCN降低63%。

关键技术方法包括：1) 使用aTc诱导的MP6质粒进行全基因组随机突变；2) 设计低表达GFP报告系统监测PCN变化；3) FACS筛选高产突变体；4) CRISPR-Cas9介导的recA基因敲除；5) 全基因组测序和MAGE技术解析关键突变。

基因组突变谱特征

诱导4小时即可产生稳定突变，主要呈现T:A?C:G转换偏好。值得注意的是，14%随机突变体出现srlA F168L突变，可能与应激反应相关，但该突变不影响总体突变率。

PCN报告系统优化

通过组合测试弱启动子和RBS，最终选用J23116-B0032组合构建低背景GFP报告系统，其线性检测范围最适于筛选PCN提升突变体。

recA1回复突变导致质粒多聚化

初代筛选发现高产菌株存在recA1(G161D)回复突变，导致质粒形成多聚体。通过CRISPR-Cas9完全敲除recA基因，获得仅产生超螺旋单体的改良菌株M3。

多类型质粒PCN提升

M3对含pUC起点的三种质粒（GFP报告质粒、gWiz DNA疫苗质粒、pAAV-CAGG-eGFP）分别提升5.93倍、1.93倍和8.7倍PCN；对p15A和pSC101起点质粒也分别提升1.44倍和1.68倍，显示广谱适用性。

recG突变的协同效应

M3中鉴定的85个突变通过10轮MAGE未能完全重建表型，但所有7个PCN提升的MAGE菌株均含recG R584H突变。该突变在ATP依赖的DNA解旋酶关键位点，可能通过改变复制叉动力学间接促进质粒复制。

这项研究不仅开发了具有工业应用潜力的pDNA高产菌株，更揭示了质粒复制调控的复杂性——单个基因突变(如recG)需在特定遗传背景下才能发挥增效作用。该发现突破了传统"单基因改造"思维的局限，为复杂表型的工程化改造提供了范式。研究者建立的aTc-MP6全基因组突变系统具有突变效率高、周期短（仅需4小时）的优势，可广泛应用于细菌适应性进化研究。未来通过优化培养条件和解析85个突变的互作网络，有望进一步突破pDNA生产的理论极限。