基于生物传感器辅助选择的精细化自适应实验室进化策略破解毒性化学品生物合成中的耐受性-效率权衡难题

本文提出了一种结合体内诱变(IVM)、微滴培养(MMC)系统和生物传感器高通量筛选的精细化自适应实验室进化(ALE)策略，成功解决了3-羟基丙酸(3-HP)生物合成中微生物耐受性与生产效率的权衡问题。该研究在12天内获得耐受720 mM 3-HP的大肠杆菌工程菌株，其3-HP产量达86.3 g L-1，转化率为0.82 mol mol-1甘油，为高效微生物细胞工厂构建提供了创新框架。

　　

微生物细胞工厂在绿色化学生产中展现出巨大潜力，但目标化学品的毒性往往限制其生产效率。传统自适应实验室进化(ALE)面临耗时耗力、耐受性与生产效率难以兼顾等挑战。本研究创新性地提出整合体内诱变(IVM)、自动化微滴培养(MMC)系统和生物传感器辅助选择的精细化ALE策略，以3-羟基丙酸(3-HP)为模型系统展开研究。

代谢工程构建3-HP合成通路

研究首先对大肠杆菌W3110进行系统代谢改造，删除adhE等6个基因构建底盘菌株TD，引入来自肺炎克雷伯菌的甘油脱水酶(GDHt)、激活蛋白(GDR)和γ-氨基丁醛脱氢酶(ALDH)等关键酶，优化质粒组合后获得最优工程菌TD S6，其3-HP产量达5.13 g L^-1。

精细化ALE策略加速耐受性进化

采用IVM技术构建突变文库TD-MUT作为ALE起始种群，在MMC系统中进行梯度压力进化。通过12天、8个浓度梯度的连续培养，获得耐受720 mM 3-HP的菌株，进化速度显著快于传统ALE。从最优微滴(2号)分离的菌株在含720 mM 3-HP培养基中生长良好，干重达0.6 g L^-1。

3-HP响应型生物传感器的开发与优化

从蓝色盐杆菌中发现并验证了由LysR家族转录因子HPTDR和启动子P_hpTD组成的3-HP感应系统。通过RBS工程优化构建动态范围达18.03倍的生物传感器SEN T6，其对3-HP具有高度特异性，检测线性范围为1-10 g L^-1(R²=0.979)。

生物传感器辅助高产菌株筛选

将生物传感器整合至进化菌株，建立"荧光强度-产量"相关性模型(r=0.967)。从1045个候选菌株中筛选出23个高产菌株，最优菌株HP0032产量达8.98 g L^-1，较对照提升74.03%。去除生物传感器元件后获得稳定菌株TDHPT S6，其摇瓶发酵产量达9.17 g L^-1，10L发酵罐中产量进一步提升至86.3 g L^-1，转化率达0.82 mol mol^-1甘油。

耐受与高产机制解析

转录组分析揭示246个差异表达基因(DEG)。验证发现机械敏感通道蛋白YnaI、DNA保护蛋白Dps和外膜脂蛋白Slp的过表达显著提升3-HP耐受性。代谢重编程表现为糖酵解(gapA)和TCA循环(gltA、mdh)关键基因下调，可能减少碳损失并促进3-HP合成。qPCR证实gapA表达下调2.61倍，gltA下调1.86倍。

该研究建立的IVM-MMC-生物传感器整合策略，为微生物细胞工厂的快速优化提供了普适性框架，特别适用于有毒化学品的高效生物合成。未来可通过超高通量筛选和自动化系统进一步提升筛选效率，该策略也有望拓展至其他高价值化学品生产菌株的构建。