鹅星状病毒1型结构蛋白新型B细胞表位鉴定及其在血清学检测中的应用研究

本研究针对鹅星状病毒1型(GAstV-1)缺乏特异性单克隆抗体(mAb)和明确表位的技术瓶颈，通过原核表达重组ORF2蛋白成功制备首个GAstV-1特异性mAb A5A1，鉴定出保守P1结构域线性B细胞表位394SNREVQITQL403，并开发出灵敏度达1:128、特异性优异的间接竞争ELISA(icELISA)检测方法，为GAstV-1流行病学监测和疫苗研发提供关键工具。

　　

近年来，鹅星状病毒(GAstV)引发的雏鹅痛风症给水禽养殖业造成重大经济损失。尽管基因型GAstV-2被认为是主要流行株，但最新流行病学数据显示GAstV-1感染率持续上升，且与GAstV-2的混合感染会显著加重病症并提高死亡率。然而，与GAstV-2研究相比，GAstV-1的诊断工具开发严重滞后——缺乏特异性单克隆抗体和明确抗原表位，导致无法建立精准的血清学检测方法，也阻碍了其致病机制研究。

针对这一科学难题，江苏农牧科技职业学院（Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College）江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室的研究团队在《Poultry Science》发表了突破性研究成果。该研究通过原核表达系统制备重组GAstV-1 ORF2蛋白，免疫小鼠获得首个GAstV-1特异性单克隆抗体A5A1；运用免疫荧光(IFA)、免疫组化(IHC)和Western blot(WB)验证其特异性；通过基因截断策略鉴定出位于ORF2蛋白P1结构域的线性B细胞表位³⁹⁴SNREVQITQL⁴⁰³；基于该mAb开发出高灵敏度、高特异性的间接竞争ELISA(icELISA)检测方法。

关键技术方法包括：原核表达系统制备重组ORF2蛋白；杂交瘤技术制备单克隆抗体；免疫荧光和免疫组化进行抗体特异性验证；基因截断和表位作图技术定位B细胞表位；生物信息学分析表位结构特征；建立优化icELISA检测体系并评估其性能参数；使用80份临床鹅血清进行方法学验证。

研究结果部分：

1. 重组GAstV-1 ORF2蛋白制备：成功表达约100 kDa重组蛋白，经镍柱纯化获得160 μg/mL高纯度蛋白，WB验证其免疫反应性。

2. 单克隆抗体特性：A5A1为IgG1/κ型，能特异性识别GAstV-1感染细胞中75 kDa和90 kDa病毒蛋白，在感染鹅组织中小肠、肺和心脏呈特异性染色。

3. 表位定位：通过截断表达确定表位位于P1结构域¹³¹SNREVQITQL¹⁴⁰（对应全长ORF2的³⁹⁴SNREVQITQL⁴⁰³），三维结构显示该表位呈表面暴露的β-折叠构象。

4. 表位保守性：该表位在GAstV-1毒株间高度保守（>95%），但与GAstV-2等禽星状病毒同源区仅有20-30%相似性。

5. icELISA建立：优化后检测限达1:128血清稀释度，与GAstV-2等常见禽病血清无交叉反应，批内批间变异系数<10%，临床样本检测与IFA符合率达87.5%。

该研究的突破性意义在于：首次提供GAstV-1特异性研究工具——mAb A5A1，填补了该领域技术空白；发现的线性表位³⁹⁴SNREVQITQL⁴⁰³兼具高度保守性和型特异性，为GAstV-1诊断试剂和亚单位疫苗设计提供精准靶点；建立的icELISA方法克服了GAstV-1难以体外培养的技术瓶颈，实现了血清学大规模筛查。这些成果不仅为阐明GAstV-1致病机制奠定基础，更为有效防控鹅星状病毒混合感染提供关键技术支撑。值得注意的是，研究中发现的原核表达ORF2蛋白与天然病毒构象差异导致的抗体非中和现象，提示未来需采用真核表达系统进一步探索中和表位，这将为开发GAstV-1特异性疫苗开辟新途径。