CopC作为金属伴侣蛋白向硫氰酸脱氢酶活性位点递送铜离子的机制研究

本研究揭示了Thiolkalivibrio paradoxus来源的CopC蛋白（tpCopC）通过高亲和力结合Cu(II)/Cu(I)（log KD分别为?16.3±0.6和?11.1±0.2），在还原条件下向硫氰酸脱氢酶（TcDH）活性位点转运2.4±0.1个铜离子并激活酶活性的分子机制，首次证实CopC家族作为细菌铜伴侣（metallochaperone）参与铜酶成熟过程，为理解细菌铜稳态（copper homeostasis）及氧化还原酶组装提供新视角。

　　

Highlight

蛋白表达、纯化与表征

通过SUMO融合技术在大肠杆菌中表达并纯化tpCopC（去除30个N端信号肽），经两步金属亲和层析获得均一蛋白。质谱分析证实其分子量为14,019 Da，圆二色谱显示典型β-折叠结构，与同源蛋白pfCopC（Pseudomonas fluorescens来源）的30.83%序列一致性相符。

重组tpCopC的表征

成熟tpCopC的等电点(pI)为5.07。等温滴定量热法(ITC)测定其对Cu(II)/Cu(I)的结合亲和力达10^?16.3 M和10^?11.1 M，X射线吸收光谱证实铜配位采用典型的His-brace基序（N端组氨酸与保守DXH模体协同配位）。

讨论

作为革兰氏阴性菌周质空间铜伴侣，tpCopC通过动态还原过程（Cu(II)→Cu(I)）将铜离子递送至TcDH三核铜活性中心。该机制不同于已知的PCu_AC、Sco等铜伴侣家族，首次揭示CopC在铜酶（如LPMO、pMMO等含His-brace结构的氧化还原酶）生物合成中的关键作用。

CRediT作者贡献声明

Anastasia Y. Solovieva：研究构思、实验设计及论文撰写；Olga G. Kulikova：方法开发与数据采集；Maria G. Khrenova：理论计算与动力学分析；Vladimir O. Popov：研究指导与经费支持。

基金声明

晶体学与ITC实验由俄罗斯科学基金会（23-74-30004）资助。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Valeriy I. Zhilov博士完成ICP-MS检测，Irina Yu. Petrushanko博士协助ITC实验，并鸣谢"工业生物技术"核心设施提供的质谱分析支持。