黄连素抑制变形链球菌的抗菌机制研究：揭示其抗龋潜力及膜破坏作用

本研究系统评估了黄连素（BBR）对变形链球菌（S. mutans）的抗菌活性，通过最小抑菌浓度（MIC）、结晶紫染色、激光共聚焦显微镜（CLSM）等实验证实BBR能显著抑制浮游菌生长（MIC=100 μg/mL）、破坏生物膜形成，并首次阐明其通过膜电位去极化（DiSC3(5)检测）和基因调控（gtfB/C/D、ldh等）的双重作用机制。细胞实验证实BBR对人口腔细胞无毒性，为开发天然抗龋剂提供理论依据。

　　

研究背景

龋病是全球流行的慢性口腔疾病，变形链球菌（S. mutans）因其产酸、耐酸和生物膜形成能力成为主要致龋菌。当前临床使用的抗菌剂如氯己定存在牙齿着色等副作用，而植物源化合物因其低毒性和高选择性成为研究热点。黄连素（BBR）是从中药黄连中提取的生物碱，具有广谱抗菌活性，但其抗龋机制尚未明确。

BBR抑制浮游菌生长

通过微量肉汤稀释法测定BBR对S. mutans UA159的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）均为100 μg/mL。生长曲线实验显示，100 μg/mL和200 μg/mL BBR可完全抑制细菌增殖，且对S. gordonii和S. mitis也有抑制作用。短时处理实验（5-10分钟）证实高浓度BBR能快速杀灭细菌。

破坏生物膜结构与功能

结晶紫染色和扫描电镜（SEM）显示，BBR处理后的生物膜生物量显著减少，50 μg/mL组出现骨架断裂（黄色箭头）和孔隙增大（绿色箭头），100 μg/mL以上浓度仅残留细胞碎片（紫色箭头）。激光共聚焦显微镜（CLSM）结合SYTO 9/PI双染发现，BBR使活菌比例从82.3%降至4.1%，且成熟生物膜中死菌比例增加。菌落计数（CFU）证实BBR使生物膜细菌减少2-3个数量级。

抑制毒力因子

通过蒽酮-硫酸法检测，BBR剂量依赖性降低水不溶性胞外多糖（EPS）合成，200 μg/mL组减少76.5%。乳酸测定和糖酵解pH实验显示，BBR处理组终末pH值（6.86±0.01）显著高于对照组（4.98±0.09），且酸生成速率减缓。CLSM三维重建显示BBR使生物膜中EPS（红色荧光）和细菌（绿色荧光）分布稀疏，生物量减少63.8%。

膜破坏机制与基因调控

DiSC3(5)荧光探针检测发现，BBR引起膜电位去极化，荧光强度增加2.3倍。透射电镜（TEM）观察到BBR处理后的细菌细胞膜破裂、内容物泄漏。qRT-PCR显示BBR下调毒力基因表达：gtfD表达降低3.1倍，ldh（乳酸脱氢酶基因）下调2.8倍，双组分调控系统基因vicR、liaR和comD表达量分别减少2.4倍、1.9倍和2.1倍。

生物相容性评估

CCK-8实验表明，200 μg/mL BBR处理8小时会轻微抑制人牙龈上皮细胞（HGECs）活力（降至83.5%），但50-100 μg/mL对口腔角质形成细胞（HOKs）、牙龈成纤维细胞（HGFs）及巨噬细胞（RAW 264.7/THP-1）均无显著毒性。

研究意义

该研究首次揭示BBR通过膜破坏和基因调控双重途径抑制S. mutans，其抑制EPS合成、减缓酸生成的特性尤其适用于抗龋。未来可探索BBR与其它天然成分的协同作用，或开发为漱口水、牙膏添加剂，为龋病防治提供新策略。