金黄色葡萄球菌谷氨酸合成酶gltB基因调控持留菌形成、生物膜构建及毒力的机制研究

这篇研究揭示了金黄色葡萄球菌(S. aureus)中谷氨酸合成酶大亚基编码基因gltB通过调控谷氨酸代谢，影响持留菌(persister)形成、生物膜(biofilm)构建及毒力(virulence)的多重机制。ΔgltB突变体在稳定期对抗生素(ampicillin/norfloxacin)耐受性显著降低，外源谷氨酸可恢复其持留表型；同时突变体对热应激(56°C)、碳饥饿和氧化应激(H2O2)敏感性增强，毒力基因(eta/hla等)表达下调，血浆凝固能力、金黄色素(staphyloxanthin)合成及生物膜形成能力均显著减弱，小鼠半数致死量(LD50)提高4.8倍。该研究为开发针对持留菌和毒力的新型药物提供了潜在靶点。

　　

谷氨酸代谢枢纽：gltB基因在金黄色葡萄球菌持留与致病中的核心作用

ABSTRACT

谷氨酸代谢作为三羧酸循环(TCA)、精氨酸合成和嘌呤代谢的关键交汇点，与细菌持留表型密切相关。金黄色葡萄球菌中编码谷氨酸合成酶大亚基的gltB基因缺失后，稳定期菌株对氨苄青霉素和诺氟沙星的耐受性分别降至11天和6天即被完全杀灭，而野生株仍保持10⁶ CFU/mL存活量。外源添加谷氨酸或基因回补均可恢复ΔgltB突变体的持留能力。深入机制显示，该基因通过多重通路影响细菌应激响应与致病过程。

IMPORTANCE

作为全球主要致死性细菌病原体，金黄色葡萄球菌持留菌的形成导致抗生素治疗失败和慢性感染。本研究发现gltB不仅是耐受抗生素和多种应激的关键因子，更通过调控谷氨酸合成影响毒力表达网络，为临床应对顽固性感染提供了新视角。

材料与方法

研究选用ATCC 700926 Newman菌株构建ΔgltB突变体，通过同源重组技术获得互补株ΔgltB::pRABgltB。采用微量稀释法测定MIC/MBC，在TSB培养基中进行10天生长曲线分析。持留实验采用20 μg/mL抗生素暴露，通过CFU计数评估存活率。应激实验包括56°C热处理、PBS碳饥饿和5% H₂O₂氧化挑战。毒力表型检测涵盖金黄色素OD₄₆₂测定、兔血浆凝固实验和96孔板结晶紫染色法评估生物膜。BALB/c小鼠LD₅₀实验采用7个剂量梯度，qRT-PCR检测23个毒力/色素相关基因表达。

关键发现

抗生素敏感性

ΔgltB对氨苄青霉素、诺氟沙星和利福平的MIC/MBC均降低50%，但对万古霉素敏感性不变。在稳定期（24小时培养），突变体暴露于氨苄青霉素11天后完全灭活，而野生株仍存活4.12±0.17 log CFU/mL。

代谢补偿效应

添加10 mM谷氨酸使ΔgltB在氨苄青霉素暴露9天后存活量提升至10⁵ CFU/mL，证实谷氨酸代谢是持留形成的核心通路。互补株使诺氟沙星耐受时间从7天恢复至野生株水平。

应激响应缺陷

ΔgltB在56°C处理2小时后完全失活，而野生株存活>10² CFU/mL。碳饥饿20天后，突变体存活量较野生株低4个数量级。5% H₂O₂处理1小时即导致突变体完全灭活。

毒力网络调控

1. 色素合成：ΔgltB的金黄色素产量在48小时降低67%，相关基因crtM/crtQ表达下调5-8倍；

2. 血浆凝固：突变体丧失诱导兔血浆纤维蛋白凝块的能力；

3. 生物膜：结晶紫染色显示ΔgltB::pRAB11的生物膜量较野生株减少62%；

4. 动物模型：突变体LD₅₀达1.14×10¹⁰ CFU/mL，较野生株(2.39×10⁹ CFU/mL)毒力降低4.8倍；

5. 毒力基因：hla（α-溶血素）、lukDE（白细胞毒素）等9个毒力因子表达显著抑制。

代谢通路解析

研究绘制了gltB参与的代谢网络：谷氨酸合成酶催化2-酮戊二酸和谷氨酰胺转化为谷氨酸，后者通过三条分支影响持留形成：

1. TCA循环：经谷氨酸脱氢酶(gudB)生成2-酮戊二酸促进ATP合成；

2. 嘌呤代谢：谷氨酰胺通过磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(purF)参与嘌呤合成；

3. 精氨酸合成：氨甲酰磷酸合成酶(pyrAA/AB)将谷氨酰胺转化为精氨酸前体。

临床转化价值

该研究首次系统阐明gltB通过"代谢-持留-毒力"三位一体调控模式影响金黄色葡萄球菌致病过程。针对谷氨酸合成通路的抑制剂（如gltB特异性小分子）可能成为对抗慢性感染的双功能药物：既增强抗生素敏感性，又减弱细菌毒力。未来研究可探索gltB与σ^B应激调控网络的交叉作用，以及其在临床分离株中的保守性。