副猪嗜血杆菌ClpX蛋白在环境胁迫耐受及致病机制中的关键作用解析

本文揭示了副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis）中ATP依赖性蛋白酶ClpX通过调控应激耐受（如高温、渗透压、氧化应激）和血清抗性，显著影响细菌生物膜形成、宿主细胞黏附侵袭及系统性感染能力。研究通过构建ClpX基因缺失株（Δ-ClpX）和回补株（C-ClpX），结合小鼠和仔猪模型证实ClpX作为新型毒力因子在格莱瑟病（Gl?sser’s disease）发病中的作用，为靶向干预提供理论依据。

　　

验证ClpX缺失突变体及其回补株

通过同源重组技术成功构建副猪嗜血杆菌CF7066菌株的ClpX缺失突变体（Δ-ClpX），并利用穿梭载体pSHK3-Gm实现基因回补（C-ClpX）。PCR和Western blot验证显示Δ-ClpX中ClpX基因及蛋白完全缺失，而回补株恢复表达。上下游基因ClpP和DapE的PCR检测证实基因操作未影响相邻基因结构。

ClpX缺失削弱细菌血清抗性与生物膜形成

生长曲线分析表明ClpX缺失不影响细菌基础增殖能力。然而，Δ-ClpX在50%和90%猪血清中的存活率较野生型分别下降60%和75%，回补后显著恢复，提示ClpX通过抵抗补体介导的杀伤增强血清抗性。微孔板定量实验发现Δ-ClpX生物膜形成量减少50%，可能与细菌外基质合成受阻相关。

ClpX介导多重应激耐受

Δ-ClpX在42°C高温和30°C低温下的活菌数较野生型降低2个数量级，表明ClpX对温度应激至关重要。10 mM H₂O₂处理30分钟后，Δ-ClpX几乎全部失活，而野生型和回补株存活率>80%。3M KCl高渗环境下，Δ-ClpX存活率仅为野生型的20%，证实ClpX通过维持蛋白质稳态参与渗透压适应。

调控宿主细胞互作与致病性

Δ-ClpX对猪气管上皮细胞（NPTr）和肾细胞（PK-15）的黏附率和侵袭率分别降低70%和65%，免疫荧光显示细菌-宿主细胞接触点减少。小鼠感染模型中，Δ-ClpX在血液、脑、肺等组织的载量下降100倍，生存期延长至7天（野生型8小时内死亡）。仔猪实验显示Δ-ClpX组仅1例死亡，病理切片见肺泡结构完整，而野生型引发严重纤维素性炎症和神经元坏死。

分子机制与临床意义

qPCR分析发现Δ-ClpX感染的巨噬细胞中CCL4、IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子表达下调50%，提示ClpX可能通过激活宿主炎症反应增强致病性。序列比对显示G. parasuis ClpX与其它革兰阴性菌同源性>90%，其蛋白酶活性可能通过降解毒性蛋白聚集体或调控毒力因子稳定性发挥作用。该研究为开发靶向ClpX的抗菌策略提供新思路，尤其对防控猪群高发的格莱瑟病具有重要实践价值。