高精度C-to-G碱基编辑器的工程化开发：拓展位点选择性与靶标兼容性

本研究针对现有C-to-G碱基编辑器(CGBE)编辑范围有限、效率受序列背景制约的问题，通过系统筛选脱氨酶并构建PmCDA1基编辑器，开发出优先编辑PAM远端第3位点的CDA1△-CGBEs。该编辑器通过C端截短显著提升C-to-G编辑效率，在酵母、人类和水稻细胞中均展现卓越的靶标兼容性，且大幅降低全基因组脱靶编辑，为基因治疗和精准育种提供了新型工具。

　　

在基因组编辑领域，实现精确的单碱基替换一直是科学家追求的目标。虽然CRISPR-Cas9系统 revolutionized基因编辑技术，但其依赖DNA双链断裂的特性限制了在精细编辑中的应用。碱基编辑器(base editors, BEs)的出现为这一难题提供了解决方案，其中C-to-G碱基编辑器(CGBEs)能够实现碱基颠换，将遗传修饰范围从传统的转换突变扩展到更广泛的序列空间。然而，现有CGBEs存在明显局限：编辑窗口主要集中在PAM远端第6位点，编辑效率高度依赖AT-rich序列背景，这严重制约了其在治疗性应用中的潜力。

针对这些技术瓶颈，南京农业大学三亚研究院/江苏省植物基因组编辑工程研究中心的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表了创新性研究成果。研究人员通过对多种脱氨酶的系统筛选，发现基于海七鳃鳗(Petromyzon marinus)胞苷脱氨酶PmCDA1(简称CDA1)构建的CGBEs展现出独特的位点偏好性——优先编辑PAM远端第3位点。更关键的是，通过C端截短CDA1结构域，不仅显著提高了C-to-G编辑效率，还增强了与不同底物序列的兼容性。这种经过优化的CDA1△-CGBEs在酵母、人类细胞和水稻中均表现出色，同时大幅降低了全基因组范围内的脱靶编辑事件。

研究采用多项关键技术：通过构建不同CDA1截短变体与nCas9的融合蛋白进行编辑窗口分析；利用高通量测序评估15个内源靶位点的编辑效率；采用全基因组测序和RNA-seq分析脱靶效应；在HEK293T细胞和粳稻品种"宁粳7号"中验证跨物种适用性。这些方法系统评估了新型CGBEs的性能特征。

研究结果部分显示：

1. "CDA1-derived CGBEs exhibit an alternative editing window for C-to-G editing"：相比APOBEC家族蛋白构建的CGBEs主要编辑第6位点，CDA1-CGBEs展现出独特的第3位点偏好性，且C端融合(nCas9-CDA1)比N端融合(CDA1-nCas9)编辑效率更高。

1. "Engineering of improved CDA1-based CGBEs"：CDA1 C端截短显著提升编辑效率，其中△194截短变体在三个polyC位点的编辑效率比全长版本提高9.5-24倍，且CGBE(含UNG1)比miniCGBE编辑纯度更高(~80% vs 60%)。

1. "CDA1-based CGBEs achieve C-to-G editing with high precision"：在酵母Can1基因多个位点测试中，CDA1△-CGBEs对C3位点的编辑效率比邻近胞苷高22倍，单一位点编辑产物占45%-63%。

1. "CDA1-based CGBEs display increased target context compatibility"：在15个内源靶位点测试中，CDA1△194-CGBE平均编辑效率达22%，比常用rA1(R33A)-CGBE提高11倍，且兼容大多数NCN序列背景(效率10%-53.7%)。

1. "Analysis of genome-wide off-target DNA editing"：全基因组测序显示，CDA1△161-CGBE等截短变体将脱靶SNVs降至接近对照水平，且RNA编辑脱靶率显著低于eA3A-CGBE和rA1(R33A)-CGBE。

1. "Enhanced C-to-G editing with truncated CDA1 variants in human and plant cells"：在人类细胞中，h-CDA1△194-CGBE平均编辑效率(~16.4%)比全长版本提高1.24-15.01倍；在水稻中提升更显著(27.11-215.07倍)，平均效率达4.1%。

这项研究通过创新性的蛋白质工程策略，解决了现有CGBEs在编辑窗口和序列兼容性方面的关键限制。CDA1△-CGBEs不仅拓展了