CRISPR/Cas9基因编辑靶向修复CYBA和CYBB基因治疗慢性肉芽肿病的研究突破

本研究针对慢性肉芽肿病(CGD)这一严重的先天性免疫缺陷疾病，开发了基于CRISPR/Cas9的基因编辑策略，成功修复了CYBA和CYBB基因突变。研究人员通过优化同源定向修复(HDR)模板和高保真Cas9变体，显著降低了脱靶编辑和染色体易位风险，在造血干细胞(HSPCs)中实现了功能性活性氧(ROS)产生能力的恢复，为CGD患者提供了潜在治愈性治疗方案。

　　

慢性肉芽肿病(CGD)是一种威胁生命的先天性免疫缺陷疾病，患者由于NADPH氧化酶缺陷导致吞噬细胞无法产生杀菌的活性氧(ROS)。目前治疗方法局限，异体造血干细胞移植面临供体匹配困难和高风险并发症，而传统基因治疗难以实现生理性基因调控。这一临床困境亟待突破性解决方案。

来自丹麦奥胡斯大学医院(Aarhus University Hospital, Denmark)的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。他们针对两种常见的CGD致病基因变异——CYBA c.287+1G>T和CYBB c.252G>A，开发了多重优化的CRISPR/Cas9基因编辑策略。通过系统比较单链寡核苷酸(ssODN)、整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)和重组腺相关病毒6型(rAAV6)三种修复模板的递送效率，研究人员建立了高效安全的基因校正方案。

关键技术包括：1)使用高保真Cas9(HiFi Cas9)和配对Cas9切口酶(D10A Cas9n)降低脱靶效应；2)联合应用i53、GSE56和Ad5-E4orf6/7 mRNA增强同源定向修复(HDR)；3)开发近通用型治疗策略——通过靶向插入截短的CYBB cDNA(外显子3-13)覆盖86%的X连锁CGD患者；4)采用DISCOVER-seq和CAST-seq全面评估基因组安全性；5)利用免疫缺陷NOG小鼠模型验证编辑后HSPCs的长期植入能力。

【RNP-和rAAV6-based基因编辑CYBA变异损害HSPCs功能】

研究发现标准SpCas9和rAAV6介导的CYBA基因编辑虽可实现40%靶向整合效率，但显著降低HSPCs增殖能力和集落形成潜能。移植实验显示编辑细胞在免疫缺陷小鼠中植入能力受损，16周后骨髓中人源嵌合率显著降低。

【优化的CYBA基因编辑方法实现功能性ROS产生】

通过联合使用三种HDR增强因子，研究人员将CYBA c.287+1G>T的校正效率提升至>40%。分化后的粒细胞显示出60%的ROS产生能力恢复，远超20%的治疗阈值。rAAV6模板的HDR效率显著优于ssODN和IDLV。

【等位基因特异性编辑X连锁CGD致病CYBB变异】

针对CYBB c.252G>A变异，开发了等位基因特异性sgRNA(sg2)和通用型sgRNA(sg3)两种策略。在杂合携带者CD34⁺ HSPCs中，sg3介导的校正效率达60%，而sg2实现25%校正。功能分析显示sg3编辑可完全恢复ROS产生。

【靶向插入CYBB cDNA实现X连锁CGD近通用治疗】

创新性设计包含CYBB外显子3-13 cDNA的修复模板，通过ddPCR证实47%的等位基因靶向整合。分化实验显示40%的GFP⁺粒细胞，ROS产生恢复>50%。生物信息学分析表明该策略可覆盖86%的X连锁CGD患者。

【高保真Cas9恢复多谱系植入潜能】

DISCOVER-seq鉴定出6个显著脱靶位点，其中OT1位点编辑效率高达77.5%。HiFi Cas9将脱靶编辑限制在<5%，同时保持靶向效率。移植实验显示HiFi Cas9编辑的HSPCs在NOG小鼠中实现57.1%骨髓嵌合率，显著优于标准Cas9(<1%)。

【配对Cas9切口酶消除脱靶编辑】

D10A Cas9n配合sg3+sg4双sgRNA策略实现了与HiFi Cas9相当的靶向效率(>60%)，且完全消除可检测的脱靶编辑和染色体易位(OMTs)。CAST-seq分析显示该策略同时减少了>200bp的大片段缺失。

这项研究通过系统性优化建立了安全高效的CGD基因治疗新策略。创新性采用HiFi Cas9和配对Cas9n显著提升基因组安全性，开发的近通用型cDNA插入方案突破了患者特异性限制。特别值得注意的是，研究人员首次在造血干细胞基因编辑中实现了无脱靶效应和染色体异常的精准校正，为临床转化奠定了重要基础。研究成果不仅为CGD患者带来治愈希望，其建立的安全评估框架和优化策略也为其他遗传性血液疾病的基因治疗提供了重要参考。