DNA聚合酶主动有序置换单链DNA结合蛋白的分子机制解析

研究人员针对DNA复制过程中DNA聚合酶(DNAp)如何高效克服高亲和力单链DNA结合蛋白(SSB)屏障这一关键问题，通过单分子力谱、双色成像和分子动力学模拟等技术，揭示了T7噬菌体系统中DNAp通过C端介导的主动有序置换机制。研究发现SSB在低张力(10 pN)下通过抑制二级结构提升复制效率，而在高张力(20 pN)下则成为阻碍；分子动力学证实DNAp通过其前端碱性斑块与SSB酸性C端尾的静电相互作用，主动降低SSB解离能垒。该研究为理解复制叉处分子碰撞解决机制提供了范式，发表于《Nature Communications》。

　　

在生命活动的核心过程——DNA复制中，单链DNA结合蛋白(SSB)如同"DNA卫士"般保护暴露的单链区域，防止核酸酶攻击和二级结构形成。然而这种保护却带来一个进化悖论：SSB与单链DNA(ssDNA)的高亲和力结合（解离常数K_d达nM级）本应成为DNA聚合酶(DNAp)前进的"路障"，但实际复制过程却高效进行。这个"分子交通管制"难题困扰了学界数十年，传统观点认为SSB可能通过被动解离或集体迁移为DNAp让路，但缺乏直接证据。

针对这一基础性难题，来自中国科学技术大学的研究团队选择T7噬菌体为模型，其SSB以单体形式结合ssDNA的特性简化了研究体系。通过创新性地整合单分子光学镊子、双色荧光共定位和AWSEM(Associative memory, Water mediated, Structure and Energy Model)粗粒化分子动力学等前沿技术，研究人员首次捕捉到DNAp与SSB相互作用的动态全过程。

关键技术方法包括：(1)构建8.3 kbp双标记DNA模板用于单分子操控；(2)采用双光阱系统在10-50 pN张力下实时监测DNA长度变化；(3)通过4%荧光标记SSB示踪蛋白位移；(4)基于AlphaFold2预测全长SSB结构进行分子动力学模拟；(5)开发变点检测算法解析聚合酶/核酸酶活性转换。

力依赖的SSB调控机制

研究发现SSB对DNA复制的调控呈现显著张力依赖性：在10 pN低张力下，SSB通过抑制ssDNA发夹结构形成，使复制速率从180±10 bp/s提升至230±20 bp/s；而在20 pN高张力下，SSB反而将速率从130±10 bp/s降低至80±5 bp/s。这种"双面刃"效应源于张力对ssDNA构象的调控——低张力时ssDNA易形成阻碍复制的二级结构，而SSB的包裹可消除这种阻碍。

有序置换而非集体推动

双色成像实验颠覆了传统认知：当DNAp以约200 nt/s速度前进时，荧光标记的SSB始终保持静止，直至被DNAp逐个"剥离"。58次位移事件分析显示，62%表现为DNAp主动接近SSB（距离缩短），仅26%出现DNAp回溯。SSB在ssDNA上的扩散常数低至7±7×10^-4 μm²/s，证实其近乎静止的绑定状态。

分子动力学揭示主动剥离机制

通过AWSEM模拟发现，SSB解离过程存在三个特征状态：结合态（蛋白-DNA距离1.3-2.0 nm）、中间态（~2.7 nm）和解离态（3.5-4.0 nm）。关键发现是DNAp通过其前端碱性斑块（含K587/K589/R950/R951）与SSB酸性C端尾（E214/E222）形成强静电作用，将SSB从ssDNA上"撕下"。这种相互作用使解离能垒从~10 kcal/mol（突变体SSB-Δ21C）降至~3 kcal/mol。

C端尾的关键作用

截断SSB C端21个氨基酸的突变体实验证实该区域的核心功能：在150 nM饱和浓度下，野生型SSB使复制速率提升20%，而突变体却降低25%。单分子数据显示突变体SSB显著增加核酸酶活性概率（从22.9%升至54.8%），并延长暂停时间（从15 s增至45 s），表明其作为无效路障的特性。

这项研究首次从时空维度解析了DNAp与SSB的协同机制，提出"有序主动置换"模型：DNAp并非被动等待SSB解离，而是通过C端介导的分子间相互作用主动降低能垒，实现"保护性剥离"。该机制既维持SSB的持续保护，又确保复制高效进行，为理解复制叉处蛋白质冲突解决提供了普适性框架。研究还启示人工设计SSB变体可能成为调控复制保真度的新策略，对基因组稳定性研究和抗病毒药物开发具有重要参考价值。