综述：枯草芽孢杆菌高价值生物制造的工程化：最新进展与应用

这篇综述系统总结了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为微生物细胞工厂的工程化策略与应用进展，重点探讨了启动子工程(P43、Pgrac等)、分子伴侣(GroEL/DnaK)调控、质粒/染色体表达系统优化等合成生物技术，及其在工业酶(α-淀粉酶)、小分子(核黄素)和疫苗蛋白生产中的突破性应用，为GRAS菌株的代谢工程提供了重要理论参考。

　　

引言

作为革兰氏阳性模式菌株，枯草芽孢杆菌以其非致病性、高效分泌能力和清晰遗传背景成为理想的异源蛋白表达宿主。1997年B. subtilis 168全基因组测序完成，揭示其4.2 Mb基因组包含4106个蛋白编码基因，为后续研究奠定基础。该菌已成功应用于酶制剂、抗菌肽等功能性产品的工业化生产，其里程碑事件包括1999年核黄素(15 g/L)和2011年异丁醇的工程化生产。

工程化宿主菌株构建

野生型B. subtilis存在天然转化效率低的问题，主要源于comP基因突变和质粒pBS32编码的ComI抑制。通过CRISPR技术敲除lytC和spoIIGA等基因，可显著改善宿主性能。典型工业菌株如WB800N（缺失8种胞外蛋白酶）通过多基因编辑使α-淀粉酶产量提升101%。环境分离的野生菌株ATCC 6051经srfC/spoIIAC等基因改造后，发酵泡沫减少64%，展现出优于实验室菌株的工业适应性。

启动子工程创新

启动子类型直接影响表达效率：

• 组成型启动子：P₄₃驱动普鲁兰酶活性达8.7 U/mL；双启动子P_HpaII-P_amyE使麦芽四糖淀粉酶活性提升33%

• 诱导型系统：新型枯草菌素响应启动子实现超低本底泄漏，而IPTG诱导的P_grac212使人鼻病毒3C蛋白酶占菌体总蛋白16%

• 合成启动子设计：SETarSCoP策略开发的P_BH4转录活性较天然启动子提高3倍，串联三启动子P_HpaII使纳豆激酶活性达213.3 FU/mL

蛋白质质量控制网络

分子伴侣与蛋白酶协同调控表达效率：

1. 折叠系统：过表达GroES-GroEL使β-甘露聚糖酶产量提升125%，DnaK-DnaJ-GrpE复合物使α-淀粉酶(AmyL/AmyS)产量分别提高160%/173%

2. 分泌辅助：Sec途径相关伴侣CsaA通过电荷依赖性识别机制维持前体蛋白转运能力

3. 蛋白酶调控：dCas9-ω抑制nprB/vpr等蛋白酶基因可使目标蛋白稳定性提升95%

表达系统优化

质粒系统（如pMA0911）虽可实现高拷贝（pWB980），但工业规模更倾向染色体整合。通过CRISPR在amyE/lacA位点多重整合BgaB基因，使酶产量达菌体总蛋白53.4%。最新开发的非抗性质粒pHT1654使热稳定BgaB占比提升至25%。

应用突破

• 小分子生产：通过purR敲除和合成操纵子（guaB-ribA等）工程化，核黄素产量达3.48 g/L；表面活性素工程菌SURb8通过分支脂肪酸途径优化产量达12.8 g/L

• 工业酶制剂：双启动子P_HpaII-P_yB使碱性蛋白酶在5L发酵罐产量达34,050 U/mL；磷酸盐限制策略使麦芽四糖淀粉酶活性提升679.15 U/mL

• 疫苗开发：口服表达HcGAPDH的重组菌显著增强反刍动物免疫力，而孢子表面展示技术为粘膜疫苗递送提供新思路

与大肠杆菌的比较优势

相比E. coli，B. subtilis的核心优势体现在：

1. 分泌效率：60%工业酶市场占有率（如枯草菌蛋白酶）

2. 生物安全性：GRAS认证适用于食品/医药领域

3. 发酵稳定性：孢子形成增强环境抗性

   但真核蛋白翻译后修饰仍是共同挑战。

未来展望

下一代研究方向包括：启动子活性定量标准化、信号肽-编码区匹配机制解析、CRISPR介导的多基因回路优化，以及智能发酵系统集成。随着合成生物学工具的发展，枯草芽孢杆菌有望成为生物制造领域的"超级细胞工厂"。