小鼠生精小管内基因递送方法的优化及其在不育治疗中的应用研究

本研究针对体内基因编辑递送效率低下的难题，南京医科大学团队通过电穿孔技术优化小鼠睾丸生精小管的多层细胞转染条件，成功实现生殖细胞稳定编辑。研究利用mTmG荧光报告系统可视化评估转染效率，发现65V电压下RNP(核糖核蛋白)形式CRISPR/Cas9编辑效果最佳，并首次在CK137956-/-小鼠中修复晚期生精阻滞表型。该成果为遗传性不育的基因治疗提供了新型物理转染方案。

　　

基因编辑技术照亮男性不育治疗新曙光

全球约15%夫妇面临不孕不育困扰，其中男性因素占比近半。传统辅助生殖技术对生精阻滞型无精症束手无策，而基因编辑为这类遗传性疾病带来希望。然而，体内基因递送始终面临三大难题：复杂组织的转染效率低、生殖干细胞靶向性差、编辑效果难以可视化评估。南京医科大学的研究团队独辟蹊径，以小鼠睾丸为模型，展开了一场突破生精小管"铜墙铁壁"的基因治疗攻坚战。

研究人员采用电穿孔技术结合四种递送形式（质粒、mRNA、蛋白、RNP），通过mTmG双荧光报告系统实时监测编辑效率。实验选用3-5周龄和16日龄C57BL/6J小鼠，建立Ythdc2^-/-（精母细胞期阻滞）和CK137956^-/-（圆形精子细胞期阻滞）两种不育模型。关键技术包括：计算机辅助精子分析(CASA)评估精子活力，T7核酸内切酶I验证编辑效率，以及免疫荧光共定位DDX4/SCP3/PLZF等生殖细胞标志物。

电穿孔条件优化

通过EGFP-N1质粒转染发现，65V电压使转染效率提升6倍（P=0.0015），荧光信号均匀分布于生精小管腔。有趣的是，16日龄小鼠因生精上皮较薄，40V即可实现基底精原干细胞转染，流式检测阳性细胞数增加3倍。

递送形式比较

RNP形式展现独特优势：在mTmG小鼠中形成稳定编辑克隆，6周后仍可检测到GFP⁺精子。而质粒形式虽体外效率高，体内却几乎无效，揭示分子形态对递送效率的关键影响。

不育表型修复

在CK137956^-/-模型中，RNP编辑使60%睾丸体积增大，组织学观察到畸形精子和正常精子共存。但编辑精子未能进入附睾尾，暗示成熟过程存在新障碍。而Ythdc2^-/-模型尽管实现精原细胞编辑，却无法突破减数分裂阻滞，提示早期生精阻滞可能涉及更复杂的表观调控网络。

这项发表于《BMC Biotechnology》的研究开创性地证明：电穿孔可穿透多层生精上皮靶向干细胞，RNP形式最适合体内编辑。虽然不同生精阶段阻滞的修复效果存在差异，但为遗传性不育的基因治疗奠定了方法学基础。特别值得注意的是，研究建立的mTmG可视化评估体系，为体内基因编辑疗效判定提供了新范式。未来需进一步探索：如何提高同源重组效率解决点突变问题，以及为何编辑精子在附睾成熟受阻。这些发现将推动基因编辑技术向临床转化迈出关键一步。