流感病毒核蛋白S69磷酸化调控病毒复制的分子机制研究

本研究针对流感A病毒(IAV)核蛋白(NP)磷酸化调控机制这一关键科学问题，通过质谱分析鉴定出S69这一新型磷酸化位点。研究人员发现NP S69磷酸化通过破坏NP-PB2相互作用降低vRNP聚合酶活性，同时抑制NP与importin-α3的结合从而阻碍核输入。该研究揭示了NP磷酸化调控IAV复制的新机制，为抗流感药物开发提供了潜在靶点。

　　

流感病毒每年造成全球范围的季节性流行，其核蛋白(NP)作为病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物的核心组分，在病毒基因组包装和复制过程中发挥关键作用。虽然已知NP的磷酸化修饰可调控病毒生命周期，但具体分子机制仍有待阐明。中国科学院微生物研究所的研究团队在《Animal Diseases》发表最新研究成果，首次鉴定出NP上高度保守的S69磷酸化位点，并系统阐明了该位点磷酸化通过双重分子机制抑制流感病毒复制的全过程。

研究采用磷酸化蛋白质组学、分子病毒学和细胞生物学等多学科技术方法，主要包括：(1)磷酸化蛋白质组学鉴定NP磷酸化位点；(2)反向遗传学系统构建S69突变病毒株；(3)微型基因组报告系统检测vRNP聚合酶活性；(4)免疫共沉淀分析蛋白相互作用；(5)免疫荧光和细胞分馏技术追踪NP亚细胞定位。研究队列包括MDCK、A549和HEK293T等细胞系以及BALB/c小鼠模型。

Serine 69 (S69) is identified as a phosphorylated residue in the NP of IAV

通过磷酸化蛋白质组学技术，研究人员从WSN(H1N1)病毒感染的细胞中成功鉴定出NP S69这一新型磷酸化位点。序列分析显示该位点在所有IAV亚型中高度保守，结构预测表明S69位于NP表面且处于PB2结合域内。磷酸化特异性抗体检测证实S69在病毒感染过程中确实发生磷酸化修饰。

NP S69 phosphorylation impairs virus replication in vitro

利用反向遗传学系统构建的S69A(去磷酸化模拟)和S69E(磷酸化模拟)突变病毒显示：S69A病毒复制能力与野生型相当，而S69E突变完全丧失感染性。Western blot分析发现S69E突变显著降低病毒蛋白表达，表明S69磷酸化对病毒复制具有强烈抑制作用。

NP S69 dephosphorylation has little effect on viral replication and pathogenicity in mice

动物实验显示，S69A突变病毒与野生型病毒在小鼠模型中引起相似的体重变化、肺组织病理损伤和病毒载量，证实NP S69去磷酸化对病毒体内复制和致病性影响有限。

NP S69 phosphorylation decreases viral polymerase activity by impairing NP binding to PB2

微型基因组报告系统显示S69E突变使vRNP聚合酶活性降低50%以上。进一步机制研究表明，S69磷酸化特异性破坏NP与PB2的相互作用，但不影响NP寡聚化或与PB1/RNA的结合，这解释了聚合酶活性下降的原因。

NP S69 phosphorylation inhibits the nuclear import of NP by impairing its interaction with importin-α3

免疫荧光和细胞分馏实验证实S69E突变显著抑制NP核定位。分子机制上，S69磷酸化选择性破坏NP与核转运受体importin-α3的相互作用，而对其他importin-α亚型无影响，阐明了核输入受阻的具体通路。

该研究首次揭示NP S69磷酸化通过"双重制动"机制调控流感病毒复制：一方面通过破坏NP-PB2相互作用抑制vRNP聚合酶活性，另一方面通过干扰NP-importin-α3结合阻碍核输入。这些发现不仅完善了对NP翻译后修饰调控病毒复制机制的认识，更重要的是，高度保守的S69位点及其独特的调控机制为开发广谱抗流感药物提供了新靶点。研究采用的磷酸化位点鉴定与功能分析策略也为其他病毒蛋白修饰研究提供了方法学参考。值得注意的是，S69磷酸化模拟突变(S69E)的致死性效应提示，针对该位点的激酶抑制剂可能成为抗流感药物开发的新方向。