单细胞转录组解析猕猴桃叶片细胞发育轨迹揭示抗寒性差异的关键调控基因

本研究针对猕猴桃(Actinidia chinensis)抗寒性机制不清的问题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术构建了"红阳"(HY)及其转AaBAM3.1基因株系(HT)叶片的单细胞转录图谱。研究发现两种基因型在保卫细胞和叶肉细胞发育轨迹上存在显著差异，鉴定出TIFY转录因子家族成员AaTIFY通过负调控JA信号通路降低抗寒性。该研究为木本果树抗寒育种提供了单细胞水平的理论依据，相关成果发表于《Horticulture Advances》。

　　

猕猴桃作为富含维生素C的重要经济果树，其商业主栽品种"红阳"(A. chinensis 'Hongyang')存在抗寒性差的突出问题。虽然前期研究发现过表达β-淀粉酶基因AaBAM3.1能提高抗寒性，但单细胞水平的调控机制仍不清楚。传统转录组分析难以揭示不同细胞类型的特异性响应，而单细胞技术的发展为解析植物器官发育和胁迫响应的细胞异质性提供了新机遇。

中国农业科学院郑州果树研究所的研究人员采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，对30天组培苗的HY和HT株系叶片原生质体进行测序，获得5,611个(HY)和13,466个(HT)高质量细胞。通过UMAP聚类分析鉴定出8种细胞类型，包括3种叶肉细胞、表皮细胞、保卫细胞、木质部细胞、韧皮部细胞和韧皮部伴随细胞。利用Monocle2软件构建伪时间轨迹，结合基因过表达和低温处理实验，系统解析了不同抗寒性基因型的细胞发育差异机制。

关键技术包括：1) 叶片原生质体制备与单细胞文库构建；2) UMAP聚类分析和细胞类型注释；3) 伪时间轨迹分析(Monocle2)；4) 差异表达基因筛选(log₂FC≥1.5, P<0.05)；5) AaTIFY基因过表达株系创制与低温胁迫表型分析(2℃处理2h)。

研究结果：

1. 单细胞转录图谱构建

   测序数据显示HT株系的细胞数量是HY的2.4倍，平均每个细胞检测到2,104个UMIs。基于保守标记基因鉴定出8种细胞类型，其中保卫细胞比例在HT中从40%降至2%，而叶肉细胞比例显著增加。

1. 细胞特异性标记基因鉴定

   发现463个叶肉细胞_1特异性基因，其中光合相关基因(如RBCS1)在HT中上调。保卫细胞特异性表达bHLH转录因子，表皮细胞高表达细胞色素P450基因。

1. 基因型间转录组差异

   HT保卫细胞中光合和JA信号通路基因下调，而叶肉细胞中活性氧响应基因上调。鉴定出47个差异表达转录因子，包括下调的TIFY家族基因和上调的NAC基因。

2. 保卫细胞发育轨迹分析

   伪时间轨迹显示HY细胞主要分布在发育早期(命运1-2)，HT细胞集中在后期(命运3)。BEAM分析发现HSP27.4等热激蛋白在命运3高表达，而淀粉合酶基因表达降低。

1. 叶肉细胞分化调控

   HT叶肉细胞中光合基因下调，而类黄酮合成和碳固定基因上调。WRKY和ERF转录因子在抗寒响应中起关键作用。

2. AaTIFY功能验证

   过表达AaTIFY株系(OE8-1等)在2℃处理下表现出更严重的萎蔫症状，F_v/F_m值降低21-33%，电解质渗漏率增加1.8倍，证实该基因负调控抗寒性。

该研究首次构建了猕猴桃叶片的单细胞转录图谱，揭示抗寒性差异与细胞类型比例变化和发育轨迹重编程密切相关。发现AaTIFY通过抑制JA信号通路负调控抗寒性，为果树抗逆育种提供了新靶点。研究建立的单细胞分析体系为木本植物细胞生物学研究提供了方法学参考，推动果树性状研究进入单细胞分辨率时代。技术层面，将scRNA-seq成功应用于多年生果树，克服了原生质体制备困难；理论层面，阐明了淀粉代谢(AaBAM3.1)与JA信号通路(TIFY)的协同调控网络，为复杂农艺性状解析提供了新范式。