CRM197融合增强大肠杆菌表达的SARS-CoV-2刺突蛋白免疫原性：广谱中和抗体与交叉保护新策略

本研究创新性地将白喉毒素无毒突变体（CRM197）与SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）融合表达，通过大肠杆菌系统成功制备CRM-RBD融合蛋白。实验证实该融合策略显著增强RBD的免疫原性，诱导Th1偏向性细胞免疫和广谱中和抗体，有效降低Delta/Omicron变异株的免疫逃逸，小鼠攻毒实验显示其可显著减轻肺部病理损伤。该研究为开发高安全性、易量产的新冠亚单位疫苗提供了新思路。

　　

高效表达与结构特征

研究团队成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达SARS-CoV-2 RBD（Asn³³¹-Glu⁵⁸³）及其与CRM197（Met¹-Arg¹⁸⁷）的融合蛋白CRM-RBD，两者均以包涵体形式存在。通过离子交换层析（IEX）和尺寸排阻色谱（SEC）纯化后，动态光散射（DLS）显示CRM-RBD粒径达10.29±0.07 nm，显著大于未折叠状态（0.76±0.01 nm）。内源性荧光光谱分析证实，复性后CRM-RBD最大发射波长蓝移至349 nm，提示芳香族氨基酸残基正确包埋。AlphaFold2结构预测揭示，CRM197的融合使RBD受体结合基序（RBM）构象稳定性显著提升。

免疫应答优势

BALB/c小鼠三剂免疫实验显示，50 μg CRM-RBD诱导的RBD特异性抗体滴度（GMT 291,930）与sRBD相当，但对变异株的竞争抑制（CI）率更优：针对Omicron的免疫逃逸率较sRBD降低1.8倍。IgG亚型分析发现CRM-RBD组IgG2a/IgG1比值下降40%，ELISPOT检测显示其诱导的IFN-γ分泌细胞（SFC）数量比sRBD高2.3倍，证实Th1型免疫应答优势。值得注意的是，CRM-RBD激发的T细胞反应对原型株与变异株（Delta/Omicron）的交叉反应性高度一致（R²>0.95）。

攻毒保护效力

K18-ACE2转基因小鼠攻毒实验中，50 μg CRM-RBD免疫组对原型株和Delta变异株的存活率均达100%，而对照组死亡率分别为60%和32%。肺部病毒载量检测显示，CRM-RBD高剂量组病毒RNA拷贝数降低3个数量级。组织病理学评分系统证实，CRM-RBD免疫小鼠仅见局部肺泡隔轻度充血，而对照组出现广泛肺泡出血、支气管腔阻塞及血管内血栓形成。

机制与转化价值

该研究首次揭示CRM197通过双重机制增强疫苗效果：作为分子佐剂稳定RBD空间构象，同时通过TLR4/MyD88通路激活固有免疫。大肠杆菌表达体系使该疫苗成本降至哺乳动物细胞系统的1/20，且冻干制剂在4°C下稳定性超过12个月。这些发现为应对快速变异的冠状病毒提供了兼具广谱性、可及性的疫苗开发新范式。