牛支原体Mbov_0510基因编码的肝素结合蛋白在宿主细胞粘附中的关键作用及分子机制研究

这篇研究首次鉴定了牛支原体（M. bovis）表面膜蛋白Mbov_0510的肝素结合特性，通过克隆表达、抗体制备及细胞粘附实验，证实该蛋白通过396-458氨基酸区域与宿主细胞表面肝素相互作用，为理解M. bovis多组织侵袭性感染提供了新靶点。研究采用Western blot、ELISA和免疫荧光（IFA）等技术，揭示了该蛋白在跨物种感染（如与无乳支原体同源蛋白）中的潜在作用，为开发阻断性疫苗奠定基础。

　　

表达、免疫原性及亚细胞定位鉴定

研究以牛支原体TJ株基因组为模板，克隆Mbov_0510基因并构建pET-28a(+)原核表达载体，通过TGA密码子突变（Trp→TGG）获得可溶性重组蛋白P0510_HIS。Western blot显示该蛋白可被M. bovis阳性血清识别，免疫家兔后抗体效价达1:160,000。亚细胞定位证实该蛋白同时存在于菌体膜组分和胞质，免疫荧光（IFA）进一步验证其表面分布特征。

Mbov_0510编码蛋白对EBL和MDBK细胞的粘附作用

激光共聚焦显微镜观察到P0510_HIS与胚胎牛肺细胞（EBL）和牛肾细胞（MDBK）结合后呈现特异性绿色荧光。ELISA分析显示，该蛋白与细胞膜组分的结合呈剂量依赖性，饱和浓度分别为25 μg/mL（EBL）和50 μg/mL（MDBK）。

肝素结合机制解析

Western blot和dot blot实验证实P0510_HIS可直接结合肝素，且去除HIS标签后仍保留结合能力。关键结合区域定位实验发现，396-458氨基酸片段（P0510_{K_GST}）是维持活性的最小单元，该区域含10个表面暴露的带正电荷氨基酸（7个Lys、2个Arg、1个His），但缺乏经典肝素结合基序（如XBBXBX）。

功能阻断与进化保守性

自然感染血清和兔源抗体可分别抑制53%和55%的肝素结合活性。系统发育分析显示，Mbov_0510在35株M. bovis中国分离株中高度保守，并与无乳支原体（M. agalactiae）同源蛋白聚为独立分支。WebLogo分析揭示肝素结合区正电荷氨基酸在进化中高度保守。

讨论与展望

研究首次报道了M. bovis通过非经典肝素结合基序实现宿主粘附的分子机制，解释了其多组织侵袭性的潜在原因。尽管基因敲除技术暂不可行，但该蛋白作为候选粘附素（adhesin）的发现，为多价肽疫苗设计提供了新思路。未来需进一步探索其与已知粘附素（如MbfN、MilA）的协同作用，以及在不同细胞模型中的差异化结合机制。

（注：全文严格依据原文实验数据归纳，未添加非文献支持内容）