新型II-D型Cas9d核酸酶NsCas9d的发现与机制研究：一种产生3核苷酸黏性末端的紧凑基因组编辑工具

本研究针对当前CRISPR-Cas9系统体积过大限制AAV递送的瓶颈问题，首次解析了来自硝化螺旋菌的II-D型Cas9d核酸酶NsCas9d的冷冻电镜结构，揭示其识别5'-NRG-3'PAM的分子机制。研究发现NsCas9d不仅能产生独特的3-nt黏性末端，其700氨基酸的紧凑尺寸更为AAV递送提供了新选择，为基因治疗工具开发开辟了新方向。

　　

基因编辑领域长期面临着一个关键挑战：如何将功能强大的CRISPR-Cas9系统装入容量有限的腺相关病毒(AAV)载体？目前广泛使用的SpCas9(1368个氨基酸)等工具因体积过大难以满足临床递送需求。虽然科学家已发现SaCas9(1053aa)等较小变体，但编辑效率与包装效率仍难兼得。更令人困扰的是，常规Cas9产生的平末端不利于精确修复，这促使研究者不断寻找更理想的编辑工具。

来自国内研究机构的研究团队将目光投向了CRISPR系统的"活化石"——II-D型Cas9d蛋白。这类仅约700个氨基酸的核酸酶被认为是Cas9与远古祖先IscB蛋白间的进化过渡形态。通过对硝化螺旋菌(Nitrospirae bacterium RBG_13_39_12)宏基因组数据的挖掘，研究人员鉴定出NsCas9d这一新成员，并系统研究了其分子特性。相关成果已发表于《Nature Communications》。

研究主要采用冷冻电镜技术(2.86?分辨率)、PAM耗竭分析、体外切割实验和哺乳动物细胞编辑评估等方法。宏基因组来源的样本通过大肠杆菌表达系统获得重组蛋白，HEK293T细胞用于验证基因编辑功能。

NsCas9d识别5'-NRG-3'PAM序列

通过系统发育分析将162个Cas9同源蛋白分类时，II-D型Cas9d自成独立分支。PAM耗竭实验显示NsCas9d优先识别5'-NGG-3'序列，体外切割证实其对NRG(R=A/G)的兼容性。关键残基K662通过水分子与PAM碱基相互作用，K728和N664则分别稳定G(-2)和G(-3)位点。

NsCas9d产生3-nt黏性末端

冷冻电镜结构首次捕捉到HNH催化域(H387)与目标链的活性构象，测序证实其在3-4位点切割；而非目标链在RuvC域(D10附近)的6-7位点断裂，形成独特的3核苷酸5'突出端。这种切割模式显著区别于产生平末端的常规Cas9，却与Cas12相似，可能更利于同源定向修复。

紧凑的sgRNA架构

156-nt的sgRNA采用类似IscBωRNA的假结结构，但比典型Cas9的sgRNA更复杂。关键发现是P1茎环可截短至136nt而不影响活性，这使其尺寸与SpCas9的sgRNA相当。结构分析揭示N659与重复序列的特异互作是组装核心。

哺乳动物细胞中的编辑活性

尽管NsCas9d在体外展现媲美SpCas9的切割效率，但EMX1位点编辑实验显示其在HEK293T细胞中的效率较低。研究者推测这与PAM识别时较弱的碱基相互作用有关，提示通过蛋白工程优化互作网络可能提升性能。

这项研究不仅填补了II-D型Cas9结构信息的空白，更揭示了CRISPR系统从IscB到现代Cas9的进化路径。NsCas9d的三大特性——紧凑尺寸(762aa)、高效NRG-PAM识别和黏性末端产生能力，使其成为AAV递送基因治疗的理想候选。特别值得注意的是，3-nt突出端可能改善NHEJ介导的基因插入效率，为精准医疗提供新工具。未来通过理性设计增强其细胞内的编辑活性，或将开辟基因组编辑的新纪元。