基于数字微流控技术的微型化CRISPR筛选平台在原发性细胞中实现单供体分辨率的功能基因组学发现

本研究针对传统电转染技术在原发性细胞基因编辑中细胞需求量高、通量低的问题，开发了新一代数字微流控（DMF）电转染平台。研究人员通过48通道可编程反应系统，实现了低至3,000个细胞/条件的CRISPR-Cas9 RNP高效递送，在骨骼肌成肌细胞、CD4+T细胞等模型中完成基因敲除（KO）和同源定向修复（HDR）。该平台成功应用于人类CD4+T细胞耗竭调控因子的阵列筛选，发现SIN3A、SETBP1等新型表观遗传调控靶点，为稀有细胞群体的基因组工程提供了可扩展解决方案。

　　

在基因治疗和功能基因组学研究领域，原发性细胞的基因编辑效率一直是制约研究进展的关键瓶颈。传统电穿孔技术需要百万级细胞输入，使得稀有细胞群体（如患者来源样本或调节性T细胞）的研究举步维艰。更棘手的是，现有技术难以支持大规模平行实验，严重限制了在免疫工程、肿瘤免疫治疗等领域的应用探索。

针对这一挑战，DropGenie的研究团队在《Scientific Reports》发表了突破性成果。他们开发的数字微流控（DMF）电转染系统，通过三液滴电极结构（Tri-Drop Electroporation）实现了纳米升级别的精确操控。该系统采用48通道可编程反应阵列，结合实验室自动化设备，仅需3,000-10,000个细胞即可完成CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的高效递送。关键技术包括：1）微流控芯片上的三液滴电转染技术；2）多通道并行处理的自动化操作系统；3）原发性细胞（人骨骼肌成肌细胞、CD4⁺T细胞等）的低输入培养方案；4）基于流式细胞术和ICE分析的编辑效率评估体系。

Evaluating the impact of cell number on transfection efficiency

研究团队首先量化了传统电转染的细胞数量依赖性。使用Lonza Nucleofector系统时，骨骼肌成肌细胞在20万细胞/条件时GFP转染效率达98.7%，但当细胞量降至2,500时效率归零。类似地，T细胞在25万输入时效率84.7%，而1万细胞时仅剩1.98%。这凸显了开发低输入技术的必要性。

High-throughput transfection in low cell densities with digital microfluidics

DMF平台通过

实现革新性突破。在3,000个骨骼肌成肌细胞中，EGFP mRNA转染效率达76.5%，且细胞活性保持48.9%融合度。对于10,000个T细胞，CD4⁺和CD8⁺亚群的GFP表达分别达92.2%和90.7%，显著优于传统方法。

Validation of gene knockout in primary human cells

在肌肉盲样剪接调节因子1（MBNL1）敲除实验中，3,000个成肌细胞即实现97.8%的编辑效率，Western blot验证蛋白表达降低84%。更令人瞩目的是，在仅占外周血CD4⁺T细胞5-10%的调节性T细胞（Treg）中，TRAC基因敲除效率达76.8%，为自身免疫病研究开辟新途径。

Efficient intracellular delivery of large DNA templates enables knock-in edits in primary T cells

平台成功实现4 kb GFP模板在TRAC位点的整合（效率52.4%），并构建出抗HER2嵌合抗原受体（CAR）T细胞，Protein L检测显示CAR表达率最高达40%。这为个性化癌症免疫治疗提供了高效、非病毒转染方案。

Arrayed CRISPR KO screen identifies genetic regulators of CD4⁺T cell exhaustion

通过28天慢性刺激模型，团队对45个耗竭相关基因进行筛选。除已知靶点LAG3外，首次发现转录共抑制因子SIN3A、SET结合蛋白SETBP1、RNA聚合酶相关因子PAF1等新型调控因子。这些靶点使LAG-3⁺细胞比例降低2-3倍，同时提升IFNγ和TNFα分泌，为逆转T细胞耗竭提供全新干预策略。

这项研究的意义在于：首先，DMF平台将原发性细胞基因编辑的细胞需求降低两个数量级，使稀有细胞群体研究成为可能；其次，阵列式CRISPR筛选揭示了CD4⁺T细胞耗竭的表观遗传调控网络，补充了现有以CD8⁺T细胞为主的研究空白；最后，非病毒载体的CAR-T构建方案为临床级细胞治疗产品开发提供更安全的技术路径。该技术框架可扩展至造血干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等更多治疗相关细胞类型，推动精准医学的发展。