马勃科真菌线粒体基因组比较分析揭示内含子动态与系统发育关系

本研究针对马勃科真菌分类争议问题，通过首次测序比较4种马勃菌完整线粒体基因组，揭示内含子和开放阅读框是导致基因组大小变异的关键因素。研究人员基于50种伞菌目和16种牛肝菌目物种的线粒体基因数据集重建系统发育树，证实马勃科为单系群且嵌套于蘑菇科内，为真菌进化研究提供重要分子证据。该成果发表于《BMC Genomics》。

　　

在真菌分类学领域，马勃科(Lycoperdaceae)真菌因其近球形的子实体结构而独具特色，不仅具有重要的药理和经济价值，还在生态系统中扮演关键角色。然而这个高价值真菌类群的分类始终存在争议——由于形态特征高度相似，加之缺乏权威专著，使得马勃科物种数量的确定成为难题。传统基于ITS、LSU等基因片段的分析方法提供的信息有限，难以准确区分形态相近物种的分类地位。在此背景下，线粒体基因组(mitogenome)因其包含丰富的基因和遗传元件，在真核生物系统发育研究中展现出独特优势。

贵州医科大学药学院的研究团队首次对马勃科的4个物种（Lycoperdon perlatum、L. pratense、Calvatia caatinguensis和C. boninensis）进行完整线粒体基因组测序和比较分析。研究发现这些线粒体基因组大小在52,694bp至62,146bp之间，均包含15个核心蛋白编码基因(PCGs)、2个rRNA基因和25个tRNA基因。比较基因组学分析揭示，内含子和开放阅读框(ORFs)是导致马勃科物种间线粒体基因组大小差异的主要因素。特别值得注意的是，Calvatia属物种含有8个内含子，远多于Lycoperdon属的2个，其中cox1和cob基因成为内含子插入的热点区域。系统发育分析基于50个伞菌目和16个牛肝菌目物种的线粒体基因数据集，采用最大似然法(ML)和贝叶斯推断(BI)构建系统发育树，结果证实马勃科为单系群，且与蘑菇科(Agaricaceae)具有最近的亲缘关系。该研究还发现随着系统发育树的扩展，牛肝菌目物种的内含子数量呈现逐渐减少的趋势。

研究采用的主要技术方法包括：从贵州混交林采集4种马勃科真菌标本，通过Illumina HiSeq 4000平台进行全基因组测序；使用Geneious Prime软件进行线粒体基因组从头组装；通过MITOS和Mfannot工具进行基因注释；利用MAUVE进行基因组共线性分析；基于15个PCGs的第一、二位密码子(PCG12)和氨基酸序列(AA)构建系统发育树。

研究结果部分包含多个重要发现：

1. 基因组特征分析显示，C. boninensis的线粒体基因组最大(62,146bp)，其内含子区域贡献了99.67%的长度差异。四个物种的线粒体基因组均呈现AT偏好性(平均65.63%)，其中atp9基因的GC含量最高(38.43%)。

2. 密码子使用分析发现ATG是主要起始密码子，而CCT(Pro)、AGA(Arg)等AT富集密码子使用频率最高，与基因组整体AT偏向性一致。

3. 重复序列分析表明L. pratense的重复序列占比最高(4.63%)，且含有最长的重复序列(179bp)。

4. 进化压力分析显示所有15个核心PCGs的Ka/Ks比值均小于1，表明这些基因均受到纯化选择作用。

5. 基因重排分析发现L. pratense的11个tRNA基因发生易位，其中8个还伴随转录方向改变。

6. 内含子动态分析鉴定出104个内含子，其中cox1基因含58个(55.77%)，cob基因含18个(16.67%)。P206(intcox1)和P429(intcob)等内含子在多个物种中保守存在，提示可能的水平转移事件。

在讨论与结论部分，研究强调了三个关键发现：首先，马勃科线粒体基因组的大小变异主要由内含子和ORFs的数量差异驱动，这一发现为理解真菌线粒体基因组进化提供了新视角。其次，内含子动态分析揭示了频繁的内含子获得/丢失事件，特别是P206和P429等保守内含子可能通过水平转移在不同物种间传播。最后，系统发育分析不仅确认了马勃科的单系性，还发现牛肝菌目物种随着系统发育分歧呈现内含子数量递减的趋势，这一规律可能与牛肝菌的形态进化（如向腹菌化的不可逆演化）相关。

该研究首次报道了马勃科真菌的完整线粒体基因组，解决了该类群在伞菌目中的系统发育位置问题。通过比较基因组学分析，揭示了内含子动态在真菌线粒体基因组进化中的重要作用，为真菌分类学和进化研究提供了宝贵的分子标记资源。这些发现不仅对理解马勃科真菌的遗传多样性具有重要意义，也为后续开展药用真菌的开发利用奠定了理论基础。