VECTOR技术：高通量评估未驯化微生物工程化潜能的创新平台及其在植物微生物组中的应用

这篇研究开发了名为VECTOR（多功能可转移复制源与抗性表征）的高通量管道，通过模块化质粒（含GFP和DNA条形码）评估植物微生物组中未驯化菌株的工程化潜力。结合光学密度（OD600）、荧光（RFU）和二代测序（NGS）技术，实现了实时监测基因转移效率，并成功分离工程菌株，为合成生物学和微生物组研究提供了可扩展工具。

　　

摘要

研究团队开发了VECTOR（多功能可转移复制源与抗性表征）技术，旨在解决传统遗传工程方法在未驯化微生物中的局限性。通过构建包含广宿主范围复制源（pBBR1、RK2、RSF1010）和转座子（mariner C9-R6K）的模块化质粒库，结合绿色荧光蛋白（sfGFP）和独特DNA条形码（Plasmid-ID），实现了对植物微生物组94种菌株的高通量工程化评估。

1 引言

传统模式微生物（如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）的工程化工具难以推广至未驯化菌株。植物微生物组中未培养菌株的独特代谢能力（如环境抗性和生物合成途径）使其成为理想的生物技术底盘，但缺乏通用遗传工具。VECTOR通过组合三种抗生素抗性基因（庆大霉素、新霉素、四环素）和复制源，结合声波液体处理机器人实现自动化接合转移，为规模化工程化提供解决方案。

2 方法

2.1 菌株培养与选择

从玉米和豌豆根系分离的94株菌（涵盖6个细菌纲）在TY培养基中培养，抗生素浓度通过预实验优化（如四环素20 μg/mL）。

2.2 质粒库构建

采用Golden Gate克隆将sfGFP和条形码插入BEVA架构质粒，包括转座子载体pMarC9-R6K。质粒通过电转化验证功能（如pNDGG071）。

2.3 高通量接合与液体筛选（VECTOR^L）

声波机器人以5:1（受体:供体）比例混合菌液，5天抗生素筛选期间每日监测OD₆₀₀和荧光（激发485 nm/发射528 nm）。

2.4 固体筛选（VECTOR^S）

接合后菌液稀释涂布于含抗生素平板，通过荧光成像（Cytation5）鉴定工程菌落。

2.5 条形码测序

碱性裂解法提取DNA，双重索引PCR扩增Plasmid-ID区域，Illumina测序后通过拷贝数校正分析质粒偏好性。

3 结果

3.1 质粒工具验证

BEVA2.0质粒（如pBBR1-Gm）和转座子载体（如pNDMS463）在模型菌（如苜蓿根瘤菌RmP110）中显示高效转移。

3.2 植物微生物组工程化

55/94株菌（如γ-变形菌纲）成功工程化，其中28株对三种抗生素均敏感。荧光数据（ΔRFU）与工程化成功率显著相关（p < 0.05）。

3.3 质粒偏好性

NGS揭示RK2在黄单胞菌目、pBBR1在假单胞菌目中效率更高，而放线菌门部分菌株意外兼容Gram-阴性质粒。

3.4 工程菌分离

VECTOR^S从25株菌中分离到荧光菌落，但50%菌株（如慢生根瘤菌USDA110）因固有抗生素抗性干扰筛选。

4 讨论

VECTOR突破了传统工程化瓶颈，其模块化设计支持扩展至古菌或真菌（如调整启动子）。局限性包括Gram-阳性菌效率低和抗生素抗性背景干扰，未来可通过添加新抗性模块（如卡那霉素）优化。该技术为合成菌群构建和基因功能研究提供了标准化工具，尤其适用于植物-微生物互作机制解析。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献结论，专业术语如OD₆₀₀、sfGFP等均保留原文格式。）