长链非编码RNA pseudo-GhFAD2-1调控棉花种子油酸/亚油酸比例及种子大小的分子机制研究

本研究首次揭示棉花lncRNA pseudo-GhFAD2-1通过招募组蛋白去乙酰化酶GhHDT1抑制GhFAD2-1转录，并竞争性结合40S核糖体蛋白GhRPS12阻碍翻译的双重调控机制，同时通过ABA信号通路调控种子大小，为棉花油脂品质改良和种子发育研究提供新靶点。

　　

长链非编码RNA在棉花种子发育中的调控机制

ABSTRACT

长链非编码RNA（lncRNAs）作为长度超过200nt的非编码转录本，在植物生长发育中发挥重要调控作用。棉花（Gossypium hirsutum）不仅是重要纤维作物，也是重要油料作物，其种子油中亚油酸（C18:2）含量超过50%。本研究鉴定到一个由GhFAD2-1D串联复制产生的lncRNA pseudo-GhFAD2-1（pGhFAD2-1），揭示了其通过表观遗传和翻译调控双重机制影响棉花种子油脂组成和发育的分子机制。

2.1 pGhFAD2-1是GhFAD2-1D的串联复制变体

通过RACE技术从陆地棉品种"新陆早33"中克隆获得Gh_D13G2237位点的全长转录本（1476bp），命名为pseudo-GhFAD2-1（pGhFAD2-1）。比较基因组分析发现，pGhFAD2-1包含两个外显子（203bp和1273bp）和一个2442bp的内含子，其序列与注释的Gh_D13G2237编码序列仅有224bp相同区域。系统进化分析表明，pGhFAD2-1同源序列仅存在于四倍体棉种的D亚基因组和二倍体D基因组棉种中，提示该复制事件发生在D基因组祖先种中。值得注意的是，复制后的序列在启动子和基因体区域发生变异，导致新的剪接事件产生无蛋白编码能力的转录本。

2.2 pGhFAD2-1调控脂肪酸组分合成

通过CRISPR-Cas9基因编辑获得9个pGhFAD2-1敲除株系（KO），以及13个过表达株系（OE）。表型分析显示，KO株系种子中亚油酸（C18:2）含量显著增加（52.58% vs CK 50.86%），而OE株系油酸（C18:1）含量显著升高（21.36% vs CK 19.00%）。油分含量测定发现KO种子含油量提高2.21%-8.81%，而OE降低1.58%-8.28%。透射电镜观察显示KO种子油体分布更为紧密。RNA-seq分析发现KO中GhFAD2-1表达显著上调，而OE中下调，同时油脂合成关键基因GhDGAT1/2在KO中高表达。

2.3 pGhFAD2-1调控棉花种子大小

种子表型测量显示，KO种子长度（8.44mm）和宽度（3.97mm）较CK（9.06mm和4.23mm）显著减小，百粒重降低8.77%；而OE种子尺寸（9.21mm和4.40mm）和百粒重（9.99g）均显著增加。石蜡切片观察发现10-20DPA为种子快速膨大期，30DPA后KO种子生长明显受限。

2.4 pGhFAD2-1缺乏蛋白编码能力

通过GFP融合表达系统和酵母表达系统验证，pGhFAD2-1最长的318bp开放阅读框（105aa）无法编码功能性蛋白，确认其作为lncRNA的特性。Western blot检测未发现pGhFAD2-1编码产物，而阳性对照GhFAD2-1-GFP显示明显信号。

2.5 pGhFAD2-1互作蛋白鉴定

RNA pull-down联合质谱分析鉴定到两个关键互作蛋白：组蛋白去乙酰化酶GhHDT1和40S核糖体蛋白GhRPS12。RNA免疫共沉淀（RIP）实验进一步证实pGhFAD2-1与这两个蛋白的特异性结合。亚细胞定位显示GhHDT1主要定位于细胞核，而原位杂交证实pGhFAD2-1与GhFAD2-1D在种子中的共定位。

2.6 pGhFAD2-1通过招募GhHDT1在转录水平调控GhFAD2-1

电泳迁移率变动分析（EMSA）和酵母单杂交（Y1H）实验证实GhHDT1可直接结合GhFAD2-1启动子区（-600至-800bp）。Western blot显示KO中GhFAD2-1蛋白积累增加，酶活提高；而OE中呈现相反趋势。同时发现GhHDT1蛋白水平在KO中降低，OE中升高。染色质可及性分析（ATAC-seq）显示pGhFAD2-1通过改变GhFAD2-1启动子区染色质开放状态调控其表达。

2.7 pGhFAD2-1在翻译水平与GhFAD2-1竞争结合RPS12

微量热泳动（MST）测定显示，pGhFAD2-1与RPS12的结合亲和力（K_d=0.69μM）高于GhFAD2-1 mRNA（K_d=1.52μM）。竞争性实验表明pGhFAD2-1可显著削弱RPS12与GhFAD2-1 mRNA的结合（K_d增至5.15μM）。基因编辑产生的pGhFAD2-1突变体（pGhFAD2-1mut）丧失竞争结合能力，证实特定序列的关键作用。

2.8 pGhFAD2-1参与GhHDT1表达的反馈调节

MST分析发现pGhFAD2-1可干扰GhHDT1与其自身启动子的结合（K_d从0.51μM增至7.22μM）。双荧光素酶报告系统验证pGhFAD2-1能解除GhHDT1对其自身启动子的抑制，表明存在lncRNA介导的反馈调节环路。

2.9降低GhHDT1表达不改变脂肪酸组成但减小种子

GhHDT1-RNAi植株中，虽然GhFAD2-1转录水平升高，但蛋白水平和酶活性未显著变化，脂肪酸组成也无明显改变。然而种子尺寸显著减小（百粒重降低4.63%），体外胚珠培养实验显示培养15天后RNAi胚珠长宽分别减小21.52%和25.17%。

2.10降低GhHDT1表达增强ABA合成

激素检测发现KO种子中ABA含量较CK增加47.5%（253.81 vs 172.10ng/g），而OE降低18.86%。qRT-PCR显示KO中ABA合成关键基因GhNCED1和信号转导基因GhSRK2E显著上调。GhHDT1-RNAi植株同样显示ABA含量增加32.39%，证实GhHDT1通过抑制ABA合成通路调控种子发育。

2.11外源ABA处理减小棉花种子

体外培养实验显示，5μM ABA处理使胚珠长宽分别减小25.84%和29.41%，证实ABA对种子生长的抑制作用。这与KO表型一致，表明pGhFAD2-1-GhHDT1模块通过ABA途径调控种子大小。

3.1 pGhFAD2-1的进化起源

比较基因组学分析支持pGhFAD2-1起源于D基因组祖先种中GhFAD2-1D的串联复制事件。复制后的序列变异导致新剪接位点产生，形成无编码能力的lncRNA。该序列在四倍体棉种D亚基因组和二倍体D基因组棉种中保守存在，暗示其功能重要性。

3.2 pGhFAD2-1的双重调控机制

研究揭示了lncRNA调控基因表达的新范式：在转录水平，pGhFAD2-1通过同源序列招募GhHDT1至GhFAD2-1启动子区，引起局部染色质压缩抑制