糖尿病肾病中GSTK1与RETREG1/FAM134B介导的网状自噬通过内质网应激和凋亡减轻肾小管损伤

本研究揭示了糖尿病肾病(DN)中GSTK1-RETREG1/FAM134B通路通过调控网状自噬(reticulophagy)改善内质网(ER)应激和细胞凋亡的新机制。研究发现RETREG1在DN患者和动物模型的肾小管中表达降低，与肾功能恶化呈负相关。通过构建近端肾小管特异性Retreg1基因敲除小鼠模型，证实RETREG1缺失会加剧高脂饮食(HFD)联合链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠的网状自噬异常、ER应激和肾小管损伤。体外实验表明，过表达RETREG1可显著恢复高糖(HG)处理的HK-2细胞中网状自噬，减轻ER应激和凋亡。免疫共沉淀-质谱(IP-MS)分析发现RETREG1与GSTK1存在相互作用，沉默GSTK1会加重网状自噬减少和肾小管损伤。该研究为DN治疗提供了新的潜在靶点。

　　

糖尿病肾病(DN)是全球终末期肾病的主要病因，近年来研究表明肾小管上皮细胞(TECs)损伤是DN的早期特征，可能独立于肾小球病变。高糖(HG)、晚期糖基化终产物和血流动力学等因素导致线粒体活性氧(ROS)产生增加、内质网(ER)应激和巨自噬/自噬(autophagy)减少，最终引起TECs损伤。其中，ER应激被认为是导致TECs损伤和DN进展的关键发病机制。

研究发现网状自噬(reticulophagy)是通过选择性清除受损ER及其成分来恢复ER应激和维持ER稳态的关键过程。RETREG1/FAM134B(网状自噬调节因子1)是第一个被发现的网状自噬受体，在ER膜重塑和周转中发挥重要作用。RETREG1主要由N端胞质结构域、网状蛋白同源结构域(RHD)和MAP1LC3B/LC3B(微管相关蛋白1轻链3β)相互作用区(LIR)组成。其中，RHD结构域和LIR结构域分别负责诱导ER膜弯曲和与自噬体标记蛋白LC3结合以介导网状自噬。

研究首先检测了DN患者和动物模型中RETREG1的表达情况。Western blot和实时定量PCR(RT-qPCR)结果显示，与db/m小鼠相比，db/db小鼠肾脏中RETREG1表达降低，并且从8周到32周进一步降低。免疫组化(IHC)染色显示，RETREG1在db/db小鼠肾脏中的表达明显下调，尤其是在肾小管中。在DN患者的肾脏切片中，RETREG1也显著下调，并且随着病理分期的增加而更加明显，这与估算的肾小球滤过率(eGFR)呈正相关，与间质纤维化和肾小管萎缩(IFTA)评分呈负相关。免疫荧光(IF)检测发现RETREG1主要在db/db小鼠的肾小管中表达，在肾小球中少量表达。体外实验证实，用不同浓度(0-45 mM)的高糖处理人近端肾小管细胞系HK-2细胞后，RETREG1蛋白表达显著降低，并且呈时间依赖性下降。

为了进一步阐明RETREG1在糖尿病条件下肾小管细胞中的作用，研究人员通过将Retreg1外显子4-floxed小鼠(Retreg1^fl/fl)与Ggt1-Cre小鼠杂交，获得了近端肾小管特异性retreg1敲除株(retreg1 ptKO)。通过高脂饮食(HFD)和链脲佐菌素(STZ)注射建立DN模型。结果显示，与对照组小鼠相比，HFD和STZ诱导的Retreg1 Ctrl和retreg1 ptKO小鼠血糖水平显著升高，但糖尿病Retreg1 Ctrl和retreg1 ptKO小鼠之间的血糖和体重没有显著差异。HFD和STZ诱导的Retreg1 Ctrl小鼠尿白蛋白(ALB)肌酐比(UACR)显著升高，而在retreg1 ptKO DN小鼠中进一步升高。此外，糖尿病小鼠肾脏的苏木精-伊红(HE)、过碘酸-雪夫(PAS)和马松染色显示皮质近端肾小管扩张伴刷状缘缺失、系膜基质增殖和肾小管间质纤维化。通过免疫染色cleaved (c)CASP3(caspase 3)和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)证实了糖尿病肾脏中的凋亡。这些病变在糖尿病retreg1 ptKO小鼠中进一步加剧。Western blot检测纤维连接蛋白1(FN1)进一步证实了糖尿病retreg1 ptKO小鼠间质纤维化加重。

透射电子显微镜(TEM)检测发现，与Retreg1 Ctrl小鼠相比，HFD和STZ诱导的Retreg1 Ctrl小鼠肾TECs中ER-吞噬体数量减少，而在糖尿病retreg1 ptKO小鼠的肾小管细胞中ER-吞噬体的形成进一步减少。免疫荧光共染色自噬体标记物LC3B和ER膜蛋白CANX显示，与Retreg1 Ctrl小鼠相比，HFD和STZ诱导的Retreg1 Ctrl小鼠肾小管中点状LC3和CANX的共定位显著减少，而在HFD和STZ诱导的retreg1 ptKO小鼠中发现更明显的减少。此外，在HFD和STZ诱导的糖尿病小鼠肾小管中LC3切割量和SQSTM1/p62的积累在糖尿病retreg1 ptKO小鼠中进一步加重。免疫组化显示，与Retreg1 Ctrl小鼠相比，HFD和STZ诱导的Retreg1 Ctrl小鼠肾组织中ER应激蛋白HSPA5/BiP/GRP78和DDIT3/CHOP的表达水平明显增加，这些效应在HFD和STZ诱导的retreg1 ptKO小鼠中进一步加剧。这些数据通过Western blot分析得到进一步证实。

体外实验表明，在HK-2细胞中过表达RETREG1显著恢复了网状自噬，并减轻了高糖处理下的ER应激和凋亡。研究人员筛选出干扰效果最佳的si-RNA03转染HK-2细胞，发现高糖处理的HK-2细胞中细胞凋亡标志物cCASP3和细胞外基质标志物FN1的表达水平显著增加，而转染RETREG1 siRNA后进一步增加。相反，用RETREG1过表达质粒(RETREG1 O/E)转染可显著抑制高糖诱导的HK-2细胞中cCASP3和FN1表达的上调。此外，与对照组相比，高糖处理增加了HK-2细胞中ER应激相关蛋白HSPA5和DDIT3的表达，而转染RETREG1 siRNA后这些蛋白的表达进一步增加，而用RETREG1 O/E质粒转染则可抑制这些增加。

为了进一步研究RETREG1诱导网状自噬和肾脏保护的机制，研究人员通过免疫共沉淀-质谱(IP-MS)分析了在HK-2细胞中与FLAG标记的全长RETREG1共免疫沉淀的蛋白质。在24个与ER稳态相关的蛋白质中，研究人员对GSTK1特别感兴趣，因为已有研究表明GSTK1定位于ER并在脂肪细胞中抑制ER应激。相互免疫共沉淀(Co-IP)分析验证了RETREG1和GSTK1在HK-2细胞中的相互作用。有趣的是，GSTK1在HEK293T细胞中与RETREG1相互作用，这种相互作用不依赖于RHD结构域。此外，免疫荧光进一步证实了RETREG1和GSTK1在肾脏中的共定位，并且发现DN小鼠和患者中的共定位强度降低。

细胞组分基因本体(GO)分析表明GSTK1在ER中富集。免疫荧光共定位GSTK1和CANX进一步验证了GSTK1与ER的相互作用，表明GSTK1可能在ER稳态中发挥重要作用。为了进一步阐明GSTK1在DN肾小管损伤中的作用，研究人员将Pck2/Pepck-Cre小鼠与Gstk1^fl/fl小鼠杂交，构建了近端肾小管特异性gstk1敲除小鼠(gstk1 ptKO)。通过STZ注射建立DN模型。HE、过碘酸银(PASM)和马松染色显示糖尿病小鼠肾脏皮质近端肾小管扩张伴刷状缘缺失，以及肾小管基底膜增厚和间质纤维化。这些病变在糖尿病gstk1 ptKO组中更为严重。透射电镜观察发现，与Gstk1 Ctrl小鼠相比，糖尿病Gstk1 Ctrl小鼠肾小管细胞中ER-吞噬体数量减少，而在糖尿病gstk1 ptKO小鼠中进一步减少。Western blot检测显示，糖尿病小鼠肾组织中GSTK1和RETREG1蛋白表达均显著降低，而在糖尿病gstk1 ptKO小鼠中RETREG1进一步降低。此外，与对照组相比，糖尿病Gstk1 Ctrl小鼠肾小管中RETREG1和点状LC3的共定位减少，而在糖尿病gstk1 ptKO小鼠中进一步减少。

体外实验发现，高糖处理的HK-2细胞中GSTK1、RETREG1和LC3-II:I的表达降低，而转染GSTK1 siRNA后进一步降低。然而，高糖处理(无论是否转染GSTK1 siRNA)诱导的L