干旱胁迫下黄花茶藨子(Ribes odoratum)稳定内参基因的筛选与验证及其在基因表达标准化中的应用

本研究针对黄花茶藨子(Ribes odoratum)在干旱胁迫条件下缺乏稳定内参基因的问题，通过转录组分析和qPCR技术筛选出Cluster-37.22228等3个表达最稳定的候选基因，为后续抗逆基因功能研究提供标准化工具。研究首次建立适用于该物种的qPCR内参体系，填补了分子生物学研究的技术空白。

　　

在全球气候变化加剧的背景下，干旱胁迫已成为制约植物生长的重要环境因素。黄花茶藨子(Ribes odoratum)作为具有重要经济价值的灌木，其引种至青海高原后表现出显著的抗旱适应性，但分子机制研究长期受限于缺乏稳定的内参基因。传统使用的看家基因如ACTB、GAPDH等在胁迫条件下表达易波动，可能导致基因表达分析结果失真。

针对这一技术瓶颈，青海大学林业实验基地的研究人员联合西北高原生物研究所，通过系统性的干旱梯度实验（设置CK-T5共6组水分处理），结合高通量转录组测序（获得115.9G数据，Q30>92.88%）和多重算法验证，首次建立了适用于黄花茶藨子干旱胁迫研究的qPCR内参体系。研究发表在《Scientific Reports》的成果显示，从35个初筛候选基因中最终确定Cluster-37.22228和Cluster-37.22646作为最优内参组合，其稳定性显著优于传统看家基因。

关键技术方法包括：1）渐进式干旱胁迫实验设计（500ml/3-15天梯度浇水）；2）Illumina转录组测序与FPKM值稳定性筛选（阈值SD<3.6，CV<0.55）；3）四重算法验证（GeNorm/NormFinder/BestKeeper/Delta Ct）；4）引物特异性检测（扩增效率95.3-109.9%）。

主要研究结果：

测序结果

18个样本平均获得6.44G数据，Q20达97.31%，成功鉴定35个FPKM波动小的候选基因（如Cluster-37.23244的CV仅0.026）。

表达谱特征

候选基因平均FPKM介于2.274-77.098，其中Cluster-37.22228（GATA转录因子）和Cluster-37.24001（E3泛素连接酶AR15）等兼具表达稳定性与胁迫响应相关功能。

稳定性评估

四重算法一致性验证显示：

• GeNorm排名前五基因的M值均<0.8

• NormFinder鉴定Cluster-37.22228稳定性最佳（0.277）

• BestKeeper以Ct值标准差评估，Cluster-37.22897（UCH3）表现最优（SD=0.53）

• 综合排名显示Cluster-37.22228|Cluster-37.22646|Cluster-37.22897为黄金组合

讨论指出，筛选获得的内参基因具有重要生物学意义：Cluster-37.22228编码的GATA24转录因子可能参与光信号与干旱响应交叉调控；Cluster-37.22897（UCH3）与高温胁迫下的生物钟调控相关；而E3连接酶AR15（Cluster-37.24001）可能通过蛋白质降解途径参与胁迫应答。这些发现不仅解决了黄花茶藨子基因表达分析的技术难题，还为解析其抗旱分子机制提供了新线索。

该研究首次系统建立了黄花茶藨子干旱胁迫研究的分子检测标准，其创新性体现在：1）突破性地采用转录组驱动筛选策略；2）发现非经典看家基因的优越稳定性；3）为同属植物抗逆研究提供方法学参考。未来可进一步探究这些内参基因本身在胁迫响应中的生物学功能，推动该经济作物的分子育种进程。