嗜热链霉菌CTM50504全基因组测序揭示极端酶资源库：碱性丝氨酸蛋白酶SCKP的异源表达与分子机制研究

推荐：本研究从突尼斯A?n El-Atrous温泉分离的嗜热链霉菌CTM50504中挖掘极端酶资源，通过全基因组测序(NGS)鉴定出323种水解酶基因，包括179种蛋白酶。团队成功异源表达丝氨酸碱性蛋白酶rSCKP，解析其耐碱(pH11)、耐热(80℃)特性及钙离子依赖的催化机制，分子对接与动力学模拟揭示其底物选择性。该酶在洗涤剂工业中展现应用潜力，为极端环境微生物酶资源开发提供新范式。

　　

在极端环境微生物资源开发的热潮中，高温泉生态系统因其独特的生物多样性成为极端酶挖掘的宝库。这类被称为"extremozymes"的酶类能在高温、高盐、强碱等苛刻条件下保持活性，但其基因组适应机制和工业应用潜力尚未充分探索。来自斯法克斯大学生物技术中心（Centre of Biotechnology of Sfax, CBS）的研究团队瞄准这一领域，从突尼斯Korbous地区59℃的A?n El-Atrous温泉分离到一株多嗜极放线菌Streptomyces cyaneofuscatus CTM50504，通过整合基因组学、蛋白质工程和计算生物学手段，系统解析了其水解酶资源库，并聚焦碱性丝氨酸蛋白酶开展深度功能表征。相关成果发表于《International Journal of Biological Macromolecules》，为工业用极端酶开发提供了新思路。

研究采用Illumina NextSeq? 500平台完成全基因组测序，通过Trimmomatic质控和SPAdes组装获得8.59 Mb基因组草图。利用Bakta、eggNOG-mapper进行基因注释，AntiSMASH预测次级代谢产物基因簇。针对鉴定的sckp基因，构建pET-28b重组质粒转化E. coli BL21(DE3)，镍柱纯化后通过SDS-PAGE和酶谱分析验证。通过pH/温度梯度实验测定酶学性质，结合AlphaFold 2建模和AutoDock Vina对接，对AAPF、AAFF、AAPM三种肽底物进行100 ns分子动力学(MD)模拟，采用gmx_MMPBSA计算结合自由能。

基因组分析显示CTM50504具有71%高GC含量，含8100个编码基因，其中323个为水解酶相关基因。通过国际链霉菌基因组比对确认其与S. cyaneofuscatus NRRL B-2570^T的99.93%相似性。antiSMASH预测49个生物合成基因簇，包括10个非核糖体肽合成酶(NRPS)和6个I型聚酮合酶(T1PKS)。功能注释发现179个蛋白酶、20个脂肪酶和5个几丁质酶基因，其中丝氨酸碱性蛋白酶sckp基因通过PCR验证。

重组表达的rSCKP经亲和纯化获得15.9倍纯化效果，SDS-PAGE显示45 kDa单一条带。该酶在pH 11和80℃时活性最高，Ca²⁺可使其在90℃保持125%活性，半衰期达6-22小时。在商业洗涤剂中保持85-100%活性，显著优于对照酶PREFERENZ? S 210。底物特异性分析显示其对含苯丙氨酸的合成肽AAPF活性最高(99±2.5%)。

结构解析表明rSCKP具有9个α螺旋和25个β折叠，催化三联体为Asp27-His70-Ser278。分子对接显示AAPF结合能最低(-8.4 kcal/mol)，与Asn174形成2.26?氢键稳定过渡态。100 ns MD模拟证实AAFF复合物最稳定(RMSD 0.211 nm)，MM/PBSA计算其结合自由能ΔG为6.66 kcal/mol，关键相互作用包括Tyr230的π-π堆积和Val237的疏水作用。

该研究首次系统报道了嗜热链霉菌CTM50504的极端酶资源谱，其基因组特征揭示了高温适应的分子基础。rSCKP优异的耐碱耐热性突破了现有工业蛋白酶的应用局限，分子机制的阐明为理性设计提供了靶点。通过整合"组学"技术与生物信息学，建立了从环境样本到工业应用的极端酶开发管道，对实现绿色生物制造具有示范意义。特别值得注意的是，N174在催化中的关键作用为后续蛋白质工程改造指明了方向，而基因组中未注释基因簇的发现则暗示该菌株可能蕴含更多待开发的生物活性物质。这项来自北非高温泉微生物的研究，为极端环境微生物资源的全球化开发利用提供了典型案例。