通过泛半胱天冬酶抑制剂抑制DNA诱导的细胞凋亡和焦亡增强B细胞电穿孔效率

本研究针对B细胞基因治疗中DNA电穿孔效率低下的关键问题，通过揭示cGAS-STING通路介导的细胞凋亡和焦亡机制，创新性采用泛半胱天冬酶抑制剂Boc-D-FMK预处理策略，显著提升hEPO基因敲入效率（达4倍）和蛋白分泌水平，为基于B细胞的基因治疗和长效蛋白生产提供了突破性技术方案。

　　

在基因治疗领域，B细胞因其独特的抗体分泌能力和免疫记忆功能被视为极具潜力的治疗载体。然而，DNA电穿孔导致的细胞死亡问题长期制约着该技术的发展——当外源DNA通过电穿孔进入B细胞胞质后，会触发高达80%的细胞死亡率，使得基因编辑效率断崖式下降。这一技术瓶颈背后隐藏着怎样的分子机制？又该如何突破？

中国医学科学院基础医学研究所生物化学与分子生物学系的研究团队在《Molecular Therapy Methods》发表的重要成果给出了答案。研究人员发现，B细胞在DNA电穿孔后会同时启动凋亡（apoptosis）和焦亡（pyroptosis）两条死亡通路，其核心机制在于胞质DNA激活了cGAS-STING信号通路。通过系统性比较不同抑制剂的效果，团队创新性地采用泛半胱天冬酶抑制剂Boc-D-FMK进行预处理，使细胞存活率提升2.3倍，hEPO基因敲入效率提高4倍，血清蛋白分泌水平增加3.5倍。这项研究不仅阐明了DNA电穿孔诱导B细胞死亡的双重机制，更建立了可推广的优化方案，为基于B细胞的基因治疗和长效蛋白生产平台奠定了关键技术基础。

关键技术方法包括：1）采用Neon电穿孔系统进行RNP（核糖核蛋白）和dsDNA共转染；2）通过流式细胞术检测Annexin V/PI双染评估细胞存活率；3）利用qPCR和Western blot分析cGAS-STING通路激活标志物；4）构建靶向ROSA26安全港位点的CRISPR/Cas9编辑系统；5）使用ProQuantum免疫检测技术定量hEPO表达水平。

【DNA电穿孔诱导小鼠原代B细胞死亡】

电转4.2kb质粒或1.2kb线性dsDNA后，B细胞存活率在24小时内骤降至35%（对照组的60%），且死亡呈现剂量依赖性（5-20μg梯度实验）和序列非特异性（pX330/pUC57等多质粒验证）。流式检测显示Annexin V⁺/PI⁺双阳性细胞比例显著升高，提示同时存在早期凋亡和晚期坏死。

【DNA电穿孔诱导原代B细胞凋亡和焦亡】

WB检测发现特征性指标c-PARP（凋亡标志）和GSDMD-NT（焦亡执行蛋白）分别增加4.2倍和3.8倍。特异性抑制剂实验证实：单独抑制凋亡（Z-DEVD-FMK）或焦亡（Ac-YVAD-cmk）仅能部分挽救细胞死亡，而泛抑制剂Boc-D-FMK可使存活率从28%提升至65%（p<0.001）。

【DNA诱导的B细胞死亡由cGAS-STING激活引起】

qPCR显示Ifnb1、ISG56等干扰素刺激基因表达上调5-12倍。磷酸化蛋白检测证实p-STING、p-TBK1、p-IRF3信号级联被强烈激活。通过siRNA敲低STING表达后，细胞存活率从41%恢复至72%（p<0.01），STING抑制剂C-178同样表现出显著保护作用。

【BOC增强EGFP表达和基因敲入效率】

在ROSA26位点敲入实验中，Boc-D-FMK处理使EGFP⁺细胞比例从6.8%提升至27.4%（p<0.0001），MFI（平均荧光强度）增加3.2倍。In/out PCR和测序证实精确整合效率提高4倍。

【BOC促进hEPO表达分泌】

在体实验中，经Boc-D-FMK处理的基因编辑B细胞移植后，小鼠血清hEPO水平达到218 pg/mL（对照组仅62 pg/mL），且移植细胞在脾脏、淋巴结和骨髓中均保持较高存活率（CD80⁺记忆B细胞占比达38%）。

这项研究的重要意义在于：首次阐明DNA电穿孔通过cGAS-STING通路双重激活凋亡/焦亡是导致B细胞死亡的核心机制；建立的Boc-D-FMK预处理方案具有广谱适用性，可显著提升CRISPR编辑效率（从<7%至>25%）；验证了工程化B细胞持续分泌治疗蛋白（如hEPO）的可行性，为糖尿病、血友病等需长期蛋白替代治疗的疾病提供了新思路。特别值得注意的是，该策略在人类原代B细胞中同样有效，使GFP⁺细胞比例从4%提升至22%，展现出明确的临床转化潜力。这些发现不仅解决了基因治疗领域的关键技术瓶颈，也为免疫细胞工程化改造提供了普适性方法学参考。