SMURF1与USP5通过K63多聚泛素化拮抗调控RIPK3介导的坏死性凋亡机制研究

本研究揭示了E3泛素连接酶SMURF1和去泛素化酶USP5通过拮抗调控RIPK3的K63多聚泛素化，精确控制坏死性凋亡（necroptosis）的新机制。研究人员发现SMURF1通过催化RIPK3第55和363位赖氨酸的K63泛素化抑制坏死小体形成，而USP5通过去泛素化作用逆转该过程促进细胞死亡。该发现为肿瘤治疗（如白血病）中靶向坏死性凋亡通路提供了新策略，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

在细胞死亡的研究领域，坏死性凋亡（necroptosis）作为一种程序性坏死形式，因其独特的免疫原性特征成为近年研究热点。当细胞凋亡（apoptosis）通路受阻时，受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）与MLKL形成坏死小体（necrosome），通过膜穿孔引发细胞内容物释放，激活强烈的炎症反应。然而，这一过程的精确调控机制尚未完全阐明，特别是在肿瘤微环境中，如何通过靶向调控坏死性凋亡增强抗肿瘤效果仍是重大挑战。

韩国延世大学（Yonsei University）的研究团队通过蛋白质组学分析，首次发现SMAD泛素化调节因子1（SMURF1）和泛素特异性肽酶5（USP5）作为坏死小体的新组分，以"分子开关"形式动态调控RIPK3的K63多聚泛素化修饰。研究发现SMURF1通过其E3连接酶活性催化RIPK3第55和363位赖氨酸的K63泛素化，抑制RIPK1-RIPK3-MLKL复合体形成；而USP5则通过去泛素化作用解除这种抑制，促进坏死性凋亡进程。这种拮抗调控机制在白血病模型中展现出显著的治疗潜力，为开发新型抗癌药物提供了理论依据。该成果发表于《Nature Communications》杂志。

关键技术方法包括：1）免疫共沉淀结合质谱分析鉴定RIPK3互作蛋白；2）凝胶过滤色谱分析坏死小体复合物组装；3）位点特异性突变体构建验证关键泛素化位点；4）流式细胞术定量细胞死亡；5）白血病异种移植模型评估体内治疗效果。

SMURF1和USP5通过RIPK3在TNFα诱导的坏死性凋亡中与坏死小体关联

通过FLAG-RIPK3免疫沉淀结合质谱分析，研究人员发现SMURF1和USP5在坏死性凋亡过程中被特异性招募至坏死小体。时间进程实验显示SMURF1在刺激后2小时与RIPK3结合，而USP5在3小时才出现，暗示二者存在时序性调控关系。

SMURF1的E3连接酶活性通过抑制坏死小体形成来抑制坏死性凋亡

SMURF1敲除显著增强坏死性凋亡，表现为RIPK1/RIPK3/MLKL磷酸化水平升高和坏死小体组装加速。通过重建实验证实，只有野生型SMURF1而非酶活突变体（C699A）能逆转这种表型，说明其E3连接酶活性是关键。

SMURF1介导RIPK3的K63多聚泛素化

体外泛素化实验证实SMURF1特异性催化RIPK3（而非RIPK1或MLKL）的K63连接型泛素化。结构域分析发现RIPK3的RIMH结构域与SMURF1的WW结构域直接相互作用。使用泛素突变体的实验进一步验证了K63链特异性。

SMURF1在TNFα诱导的坏死性凋亡中介导RIPK3第55和363位赖氨酸的K63泛素化

通过系统性的赖氨酸突变筛选，研究人员鉴定出K55和K363是SMURF1介导泛素化的关键位点。双突变体（K55/363R）完全阻断了SMURF1的抑制作用，导致坏死性凋亡敏感性显著增强，其表型与SMURF1敲除细胞相似。

USP5通过其去泛素化酶功能促进TNFα诱导的坏死性凋亡

与SMURF1相反，USP5敲除抑制坏死性凋亡，表现为磷酸化水平降低和坏死小体形成减少。重建实验显示只有野生型USP5而非催化突变体（C335A）能恢复细胞死亡，证实其去泛素化活性不可或缺。

SMURF1和USP5对RIPK3 K63多聚泛素化的拮抗调控

双重敲除实验揭示SMURF1缺失时USP5无法被招募至坏死小体，而USP5缺失不影响SMURF1结合。体内泛素化分析显示USP5特异性去除SMURF1介导的K63链，而对CHIP、Parkin等其他E3连接酶催化的泛素化无影响。

SMURF1下调或RIPK3 K55/363R突变增强Birinapant/Emricasan诱导的白血病细胞坏死性凋亡

在Molm-13和NB4白血病模型中，SMURF1敲除或K55/363R突变使肿瘤细胞对birinapant（SMAC模拟物）和emricasan（半胱天冬酶抑制剂）联合处理更敏感。异种移植实验显示治疗组肿瘤体积显著缩小，证实该通路在肿瘤治疗中的潜在价值。

这项研究首次揭示了SMURF1-USP5轴通过动态调控RIPK3 K63泛素化精确控制坏死性凋亡的分子机制。该发现不仅完善了细胞死亡调控的理论框架，更重要的是为肿瘤治疗提供了新思路：通过靶向SMURF1抑制或USP5激活来增强坏死性凋亡，可克服肿瘤细胞对传统凋亡诱导剂的抵抗。特别是在血液系统恶性肿瘤中，该策略显示出显著的临床转化潜力。研究还提示K63泛素化修饰的时空特异性调控可能是细胞命运决定的关键节点，为后续探索其他程序性细胞死亡通路提供了范式。