甜樱桃PavGRF5基因负调控低温胁迫耐受性的分子机制及其在转基因拟南芥中的功能验证

本研究针对甜樱桃(Prunus avium L.)在低温胁迫下的分子调控机制不明问题，通过克隆PavGRF5基因并构建转基因拟南芥体系，结合VIGS和AsODN技术，首次揭示PavGRF5通过抑制抗氧化酶活性、增加ROS积累和降低渗透调节物质含量等途径负调控植物耐寒性。研究发现PavGRF5与PavGIF1互作形成调控模块，其表达受低温抑制可缓解对耐寒基因的负调控作用，为果树抗寒育种提供了新靶点。

　　

在果树栽培中，晚霜冻害是制约甜樱桃产业发展的主要瓶颈。这种温带水果虽然风味独特、营养丰富，但其生长极易受到春季低温的影响。目前关于甜樱桃响应低温胁迫的分子机制研究相对滞后，特别是生长调节因子GRF家族在其中的作用尚不明确。这就像面对一个精密的生物"黑匣子"，科学家们亟需破解其中的分子密码，为培育抗寒品种提供理论依据。

贵州大学山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室的研究团队将目光锁定在GRF家族成员PavGRF5上。前期研究发现该基因在低温条件下表达显著下调，暗示其可能参与冷应激响应。研究人员通过构建PavGRF5过表达拟南芥株系，结合病毒诱导基因沉默(VIGS)和反义寡核苷酸(AsODN)技术，系统解析了该基因在低温胁迫中的调控功能。相关成果发表在园艺学权威期刊《Scientia Horticulturae》上。

研究主要采用以下关键技术：通过农杆菌介导的花序浸染法获得转基因拟南芥；利用qRT-PCR分析基因表达模式；采用RUBY报告系统检测启动子活性；运用酵母双杂交(Y2H)和荧光互补(LCI)验证蛋白互作；通过生理生化指标测定评估植株抗逆性。

3.1 表达分析

研究发现PavGRF5在低温、ABA处理下表达下调，而在高温和MeJA处理初期表达上调。启动子分析发现其含有低温响应元件LTR，RUBY系统显示该启动子在茎叶连接处特异性激活。

3.5 生理响应

过表达株系在4°C处理5天后表现出更严重的冷害症状。与野生型相比，转基因植株的MDA和H₂O₂含量显著升高，而POD、SOD、CAT等抗氧化酶活性及脯氨酸、可溶性蛋白等渗透调节物质含量显著降低。

3.9 气孔调控

低温处理后，过表达植株气孔开度显著大于野生型，表明PavGRF5通过调控气孔运动影响低温响应。

3.12 蛋白互作

Y2H和LCI实验证实PavGRF5与PavGIF1存在直接相互作用。值得注意的是，低温同时抑制这两个基因的表达，可能通过解除PavGRF5-PavGIF1模块的负调控作用来激活耐寒通路。

这项研究首次系统阐明了甜樱桃PavGRF5基因的低温响应机制。研究发现该基因通过多重途径负调控植物耐寒性：一方面抑制抗氧化酶系统导致ROS积累，另一方面降低渗透调节能力，同时还影响气孔运动。尤为重要的是，研究揭示了PavGRF5-PavGIF1互作模块在低温响应中的核心地位，为理解GRF家族在非生物胁迫中的功能提供了新视角。

从应用角度看，该研究不仅丰富了植物低温应答网络的理论基础，更重要的是为分子设计育种提供了潜在靶点。通过调控PavGRF5表达或干预其与PavGIF1的互作，有望培育出抗寒性增强的甜樱桃新品种。此外，研究中建立的RUBY报告系统为果树基因功能研究提供了新的技术手段，其非侵入性、可视化的特点特别适合多年生果树的转化鉴定。这些发现对保障温带果树产业稳定发展具有重要实践价值。