PRIAMOS技术：通过混合高极化分子轨道物质实现组织样本光学透明化的pH值与折射率自由调控新方法

本文介绍了一种创新的PRIAMOS技术（pH值和折射率调整混合高极化分子轨道物质），通过将甘油中的羟基替换为硫醇基团，开发出具有更高折射率（RI 1.52-1.57）的新型包埋介质。该技术能在2-3天内实现三维组织样本的光学透明化（OC），同时保留黄色荧光蛋白（YFP）等荧光标记物的活性，为深达1.6 mm的小鼠脑组织和肾脏样本的共聚焦显微镜成像提供了理想解决方案。

　　

1 引言

生物样本通常具有不透明特性，这是由于光子在其内部传播时会发生强烈散射。光学透明化（OC）技术通过将样本包埋在高折射率（RI）介质中，使样本内部形成均匀的RI分布，从而解决这一难题。传统方法如BABB（苯甲醇与苯甲酸苄酯混合物）虽能实现良好透明化，但会导致荧光蛋白（FP）如GFP和YFP的荧光快速淬灭。水溶性物质如尿素和糖类虽能保持荧光，但最高仅能达到RI=1.48，且高粘度导致透明化过程长达1-2个月。

PRIAMOS技术应运而生，其核心原理是通过替换分子中的原子来增加分子轨道极化率：将甘油中的OH基团替换为SH基团，形成单硫甘油（RI=1.52）和二硫甘油（RI=1.574）。这两种物质可按任意比例混合，实现RI在1.52-1.57间的精确调控，完美匹配标准BABB物镜设计的RI=1.56。

2 材料与方法

实验采用四氢呋喃（THF）进行样本脱水，通过三乙胺和三亚丁胺调节pH至7-8，确保荧光蛋白活性。折射率测量使用安东帕Abbemat 200折光仪（589.6 nm，20°C）。对于Thy1-YFP转基因小鼠脑组织，采用梯度THF脱水后，用含5.4%三亚丁胺的二硫甘油（pH=7.1，RI=1.563）包埋。肾脏样本则先经CLARITY透明化处理，再直接转入单硫甘油（RI=1.52）。

成像系统配置包括：激光共聚焦显微镜（Leica HCX Apo L20×/0.95 IMM BABB物镜）和定制光片显微镜（Zeiss LD APlan 10×/0.25）。图像处理采用基于Matlab的最大似然反卷积算法，在NVIDIA游戏GPU上运行。

3 结果

通过二元混合单硫甘油和二硫甘油，RI呈现线性变化关系（图2C）。小鼠脑组织透明化后，在共聚焦显微镜下可清晰成像至1.6 mm深度，YFP荧光强度在1.5 mm处仍保持25%（图3D-E）。肾脏样本在光片显微镜下呈现良好透明度，600 μm深度仍能清晰分辨WT-1标记的肾小球结构（图4B）。

值得注意的是，硫醇基团的氧化还原活性可有效清除活性氧物种，发挥抗荧光淬灭作用。但这也带来一定毒性，需在通风橱中操作。样本会出现适度收缩，这主要源于脱水过程中THF对脂质的溶解。

4 讨论

PRIAMOS技术成功解决了传统OC方法的三大矛盾：有机溶剂导致荧光淬灭、水溶性物质RI不足、高粘度导致处理周期长。通过分子轨道工程设计的硫醇甘油混合物，既达到了BABB级别的RI值（1.56），又保持了荧光蛋白活性。阿贝数测试显示，二硫甘油（36）与单硫甘油（43）的光学性能与BABB（25-28）相当，实际成像中微小差异可通过共聚焦针孔校正。

对于CLARITY处理的样本，直接转入单硫甘油即可实现良好透明化，但需注意水凝胶包埋样本不能经历THF脱水步骤。该方法特别适合需要多色荧光成像的研究，弥补了Ou等人开发的>600 nm透明化技术的局限性。

5 结论

PRIAMOS原理为光学透明化介质设计提供了明确方向：通过替换重原子增加分子轨道极化率，在不改变分子结构的前提下提升RI值。首代硫醇甘油混合物已展现出卓越性能，未来可拓展至其他硫醇/硫醚类化合物。该技术为三维组织成像、特别是需要保留荧光活性的神经科学和发育生物学研究，提供了高效可靠的解决方案。