大黄素靶向中性粒细胞BCL-10抑制NETosis缓解脓毒症多器官损伤的机制研究

这篇研究揭示了大黄素(Emodin)通过靶向中性粒细胞BCL-10蛋白，调控BCL-10/MALT1复合物功能，抑制NF-κB信号通路激活，从而显著减少中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成，改善脓毒症(sepsis)引发的炎症-凝血异常交互作用。研究结合体内CLP模型和体外HL-60细胞实验，采用蛋白质微阵列、表面等离子共振(SPR)和单细胞测序等技术，首次证实BCL-10是促进脓毒症NETosis的关键靶点，为脓毒症治疗提供了新策略。

　　

Abstract

脓毒症是由宿主对感染反应失调引发的危及生命的器官功能障碍，其特征是过度炎症和异常凝血。中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成是连接这两个病理过程的关键环节。研究发现源自大黄的天然蒽醌衍生物大黄素能显著改善脓毒症诱导的细胞因子风暴和凝血异常，其机制是通过抑制NETs形成。蛋白质微阵列、SPR和分子对接分析证实BCL-10是大黄素的直接作用靶点。中性粒细胞条件性敲除BCL-10实验结合单细胞测序证实BCL-10在脓毒症NETs形成中的核心作用。大黄素通过调节BCL-10/MALT1复合物功能，减轻NF-κB信号激活，从而抑制NETs形成。这些发现为大黄素及其靶点BCL-10在脓毒症治疗中的转化研究提供了新线索。

1 Introduction

脓毒症是感染、烧伤、创伤和休克等危重病症的严重并发症，全球每年约有3150万脓毒症病例。传统观点认为过度感染和全身炎症反应是脓毒症的主要病理机制，但临床研究表明单纯抗炎治疗并不能显著提高生存率，提示脓毒症涉及更复杂的病理生理机制。随着研究深入，过度炎症激活和凝血功能障碍被认为是驱动疾病进展的核心机制。病原体相关分子模式(PAMPs)通过Toll样受体(TLRs)等模式识别受体激活中性粒细胞，释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)等促炎细胞因子。当感染未被有效控制时，损伤相关分子模式(DAMPs)如高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的释放会进一步放大炎症反应。临床研究显示约25-50%脓毒症患者会发生弥散性血管内凝血(DIC)，与不良预后密切相关。在脓毒症病理过程中，NETs作为炎症和凝血异常交互的关键介质发挥重要作用。BCL-10是CARD家族的关键衔接蛋白，通过形成CBM信号复合物(CARD9/BCL-10/MALT1)在先天免疫中起核心调控作用。一方面BCL-10协调PAMPs和DAMPs的识别，调节先天免疫反应；另一方面MALT1作为CBM复合物的关键下游信号介质，通过其支架和蛋白水解酶双重功能驱动NF-κB信号级联放大。这一机制不仅加强了促炎正反馈循环，还直接促进NETs释放。

2 Results

2.1 Emodin Protected against Mortality and Multiorgan Pathological Damage in Sepsis Mice

CLP诱导的脓毒症小鼠模型显示，大黄素干预组7天生存率显著高于模型组。H&E染色显示大黄素显著改善肺、肝、脾和肾脏的病理损伤：减轻肺泡破坏、炎性浸润、微血栓形成和毛细血管出血；恢复肝小叶结构，减少肝细胞脂肪变性和血管破裂；改善脾脏红白髓结构紊乱；缓解肾小管上皮水肿和间质炎症浸润。这些多器官结果表明大黄素显著降低了多器官衰竭风险，其器官保护功效优于地塞米松单药治疗。

2.2 Emodin Mitigated Systemic Inflammatory Dysregulation and Pathological Coagulation Activation Induced by Sepsis

多因子芯片检测显示脓毒症小鼠外周血浆中多种炎症因子在24小时显著上调，凝血因子激活在48小时达到峰值。大黄素干预显著抑制24小时炎症因子表达和48小时凝血因子水平。Western blot分析显示大黄素下调肝组织中组织因子(TF)、糖蛋白VI(GPVI)和音猬因子(Shh)蛋白水平，表明大黄素有助于调节脓毒症引发的全身性炎症-凝血失调。

2.3 Emodin-Inhibited NETs Formation in Septic Mice

检测脓毒症小鼠关键NETs成分发现，血浆游离DNA(cfDNA)、髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)水平显著升高。时间过程分析显示cfDNA水平在24小时显著升高，大黄素治疗显著降低cfDNA水平。Western blot显示NE、MPO和CitH3蛋白表达在脓毒症小鼠肝组织中显著上调，大黄素干预可显著抑制这些NETs标志物的表达。多重免疫荧光证实大黄素减少肝组织中MPO和CitH3阳性细胞数量及荧光强度。

2.4 Emodin-Inhibited Neutrophil NETs Formation

体外实验显示，全反式维甲酸(ATRA)分化的HL-60细胞在80 ng mL^-1 PMA刺激3小时后可有效诱导NETs形成。大黄素(10 μM)显著降低PMA刺激的dHL-60细胞中活性氧(ROS)产生和NETs相关成分(cfDNA、NE等)水平。Sytox Green染色显示大黄素显著减少NETs结构形成，免疫荧光证实大黄素降低NE表达。

2.5 BCL-10 Was Pivotal in Emodin-Mediated Inhibition of NETs Formation

生物素标记的大黄素(Bio-Emodin)与HuProt人类蛋白质微阵列孵育，鉴定出BCL-10是与大黄素结合潜力强的关键候选蛋白(SNR=25.168)。SPR分析显示大黄素与重组人BCL-10(rhBCL-10)结合的KD为1.94×10^-6 M，表明高结合亲和力。下拉实验验证大黄素能与小鼠肝组织裂解液中的BCL-10结合。分子对接显示大黄素与BCL-10结合口袋相互作用的最佳对接能为-7.59 kcal mol^-1，分子动力学模拟估算结合能为-7.03 kcal mol^-1。

2.6 Emodin-Mediated Targeting of Neutrophil BCL-10 Suppresses NETs Formation in Sepsis

单细胞转录组测序显示脓毒症小鼠外周血中中性粒细胞显著富集，大黄素干预减少中性粒细胞富集。KEGG分析显示脓毒症中性粒细胞中白细胞跨内皮迁移、NF-κB信号通路、NETs形成和血小板激活等通路显著富集。关键NETs相关基因CAMP、HMGB1和PAD4在CLP组显著上调，大黄素干预降低其表达。BCL-10在多种细胞类型中广泛表达，在中性粒细胞中显著富集，与NETs相关基因呈正相关。

2.7 BCL-10 Deficiency Improved Septic Phenotypes and NETs Formation in Mice

中性粒细胞特异性BCL-10敲除(BCL-10^-/-)小鼠与BCL-10^f/f小鼠相比，CLP诱导后死亡率显著降低，多器官病理损伤明显改善。BCL-10^-/- CLP小鼠外周血浆中TNF-α、IL-1β、CXCL1和CXCL5等炎症因子显著减少。免疫荧光显示BCL-10^-/- CLP小鼠肺和肝组织中NETs形成(CitH3)显著减少。

2.8 Single-Cell RNA Sequencing Revealed BCL-10 Deficiency Reduces Neutrophil Infiltration and NETs Formation

单细胞RNA测序显示与BCL-10^f/f CLP小鼠相比，BCL-10^-/- CLP小鼠中性粒细胞富集和比例显著降低。KEGG分析显示BCL-10^-/- CLP小鼠中性粒细胞中NF-κB信号通路、RLR信号通路和NETs形成等炎症通路显著抑制。关键NETs相关基因CAMP、HMGB1和PAD4表达显著降低。

2.9 Emodin-Inhibited NETs Formation by Regulating NF-κB Activation through Modulation of BCL-10-MALT1 Function

单细胞测序显示脓毒症小鼠中RELB、NF-κB1、NF-κB2和STAT2等转录因子显著上调，大黄素治疗降低其活性。Western blot显示CLP上调p-p65表达，大黄素治疗显著降低其磷酸化水平。类似趋势见于IκBα和IKKα/β磷酸化，大黄素有效抑制其磷酸化。多重免疫荧光显示CLP组肝组织中MALT1和BCL-10表达升高，大黄素治疗降低两者表达。BCL-10^f/f小鼠中，CLP诱导的脓毒症模型组p-p65蛋白表达显著上调，大黄素干预有效抑制这一增加；而在BCL-10^-/-小鼠中，各组间p-p65表达无统计学差异。BCL-10^-/- CLP组p-p65表达水平显著低于BCL-10^f/f CLP组。MPO和NE蛋白表达也呈现相似调控模式。

3 Discussion

本研究证明炎症和凝血的异常激活是脓毒症的标志性特征，NETs形成是连接这两个过程的关键环节。大黄素显著抑制CLP诱导的脓毒症过度炎症反应和异常凝血激活，提供显著的多器官保护作用。机制上，大黄素直接结合BCL-10蛋白，调节MALT1/BCL-10复合物，抑制NF-κB转录因子激活和磷酸化，从而减少NETs形成。中性粒细胞选择性缺失BCL-10显著减轻脓毒症诱导的器官损伤和NETs形成，进一步支持大黄素的保护作用是通过调节BCL-10-MALT1复合物功能来实现的。这些发现为大黄素作为脓毒症治疗药物的转化研究提供了关键实验证据。

5 Experimental Section

研究使用CLP诱导的脓毒症小鼠模型，大黄素(20 mg kg