羟氯喹通过调控内体酸化及T4SS表达抑制布鲁氏菌感染所致流产的机制研究

（编辑推荐）本研究首次揭示抗疟药羟氯喹（HCQ）通过双重机制抑制布鲁氏菌（B. abortus）感染导致的流产：一方面通过升高内体布鲁氏菌囊泡（eBCV）pH值抑制IV型分泌系统（T4SS）表达，减少滋养层细胞死亡；另一方面通过抑制NF-κB和MAPKs通路减轻胎盘炎症。该研究为感染性流产的临床干预提供了新策略。

　　

1. 引言

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（Brucella）引起的人畜共患病，其感染孕畜会导致胎盘炎和流产，造成重大经济损失。布鲁氏菌在胎盘滋养层细胞（trophoblasts）内依赖IV型分泌系统（T4SS）介导的效应蛋白（如VceC）促进胞内复制，最终导致细胞坏死并释放损伤相关分子模式（DAMPs），引发胎盘急性炎症。羟氯喹（HCQ）作为抗疟和免疫调节药物，在系统性红斑狼疮（SLE）妊娠中显示安全性，但其在感染性流产中的作用尚未明确。

2. 材料与方法

实验采用C57BL/6孕鼠模型，构建HA-VceC标记的B. abortus菌株，通过qRT-PCR和Western blot检测T4SS相关基因（virB11/virB4）和调控因子VjbR的表达。利用荧光探针NHS-Rho/NHS-CF测定内体囊泡（eBCV）pH值，并通过CFU实验评估细菌胞内增殖。胎盘组织病理学评分和幼崽存活率用于评估HCQ的干预效果。

3. 结果

3.1 HCQ抑制eBCV酸化

实验显示，HCQ处理使eBCV pH值从4.5-5.0升至5.6（图1），显著抑制酸性依赖的T4SS表达。

3.2 HCQ下调T4SS表达

在滋养层细胞HPT-8中，HCQ降低virB11 mRNA水平（图2A）及效应蛋白VceC的分泌（图2C），且不影响细菌体外生长（图3B），证实其作用依赖eBCV微环境调控。

3.3 HCQ抑制细菌胞内增殖

HCQ早期处理（感染后0-7小时）使B. abortus胞内载量降低10倍（图3A），而延迟处理（7小时后）无此效应，表明T4SS的早期激活是关键靶点。

3.4 HCQ减少滋养层细胞死亡

通过LDH和HMGB1释放实验（图4A-D）及PI染色（图4E）证实，HCQ通过抑制细菌复制降低细胞坏死，效果与T4SS缺失株（ΔvirB11）相当。

3.5 HCQ抑制炎症因子分泌

用感染滋养层细胞的条件培养基（CM）刺激骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）时，HCQ处理组TNFα、IL-6、RANTES和IFN-γ分泌量减少（图5A-D），且该作用独立于T4SS调控。

3.6 HCQ阻断MAPKs/NF-κB通路

Western blot显示HCQ抑制p38、JNK和ERK磷酸化（图6A），免疫荧光证实NF-κB p65核转位减少（图6B），揭示其抗炎机制。

3.7 胎盘外植体验证

小鼠胎盘外植体实验中，HCQ降低IL-6和TNFα水平（图7C-D），且早期处理能减少细菌负荷（图7B），与细胞实验结果一致。

3.8 HCQ提高孕鼠幼崽存活率

HCQ治疗使感染孕鼠的幼崽存活率从6%提升至65%（图8D），胎盘病理显示中性粒细胞浸润和细胞坏死显著减轻（图8A-C）。

4. 讨论

本研究阐明HCQ通过双重途径抗流产：T4SS依赖的细菌增殖抑制和T4SS非依赖的炎症调控。与既往抗HMGB1或孕酮治疗相比，HCQ对多种细胞因子（如IFN-γ/RANTES）的广谱抑制使其效果更优。此外，HCQ作为eBCV pH调节工具，为布鲁氏菌胞内寄生机制研究提供新思路。未来需在大型动物模型中验证其临床转化潜力。

（注：全文数据及结论均来自原文，未添加非文献依据的表述。）