"CRISPR-RCA自驱动级联放大系统AURORA：基于切割门控末端暴露的猴痘病毒超快检测新策略"

本文推荐一种基于CRISPR-Cas12a和滚环扩增(RCA)技术的一体化自驱动检测系统AURORA，通过创新设计的双功能探针(DF probe)实现切割门控的末端暴露，巧妙利用Cas12a与phi29 DNA聚合酶对不同链状态底物的作用特性，在单管反应中避免酶竞争，8分钟内即可检测到88 aM（53 copies/μL）的猴痘病毒(MPXV)DNA。该系统在36例临床样本中与qPCR结果完全一致，为传染病防控提供了超快速精准的检测工具。

　　

亮点

我们创新性地构建了基于CRISPR和滚环扩增(RCA)的切割门控末端暴露驱动型单管自放大系统（AURORA），可实现猴痘病毒(MPXV)的超快速灵敏检测。

材料与仪器

本研究使用的模板序列和crRNA序列见补充表1。质粒、crRNA和双功能探针(DF probe)购自GenScript生物科技（中国南京），Phi29 DNA聚合酶、SYBR Gold核酸凝胶染料购自赛默飞世尔科技（美国），T4 DNA连接酶、核酸外切酶等试剂购自英国NEB公司。

AURORA的设计原理

AURORA是基于CRISPR和RCA的切割门控末端暴露驱动型单管自放大系统（图1）。我们巧妙设计的DF探针包含荧光/淬灭基团、引物功能区(RNA)和切割功能区(ssDNA)。凭借Cas12a对单链DNA的高效反式切割特性，激活的Cas12a可快速剪切DF探针暴露出3'端，进而通过环状DNA模板介导的碱基配对形成引物-模板复合物，激活phi29 DNA聚合酶启动RCA。由于RCA产物含有Cas12a识别位点，可重新激活Cas12a形成正反馈自放大循环。

结论

本研究提出的AURORA策略通过构建切割门控末端暴露驱动的自放大系统，解决了Cas12a与扩增酶的底物竞争问题，结合正反馈循环使检测效率显著提升，可在10分钟内实现低至88 aM的MPXV检测，为重大传染病防控提供了高效工具。