纳米孔长读长测序技术在等位基因水平解析杂合剪接变体异构体差异的创新方法

本研究针对杂合剪接变体（splicing variants）导致的等位基因特异性转录本差异难题，开发了ISAHESVAL-NL分析流程，整合纳米孔长读长测序（nanopore long-read sequencing）与基因组数据，首次实现单样本内剪接变体功能效应的系统性评估。通过GM12878细胞系及临床样本验证，成功鉴定出PYGM基因致病性剪接变体导致的异常异构体，为罕见病诊断和个性化医疗提供了新工具。

　　

在遗传学研究和临床诊断中，杂合剪接变体（heterozygous splicing variants）的功能解析长期面临技术瓶颈。传统短读长测序难以准确识别全长转录本异构体（isoform），而现有分析方法通常需要对照样本或群体数据。这种局限性使得罕见病患者的个体化剪接变体评估效率低下，特别是当组织样本稀缺时。

东京科学研究所（Institute of Science Tokyo）的研究团队在《Scientific Reports》发表的研究中，开发了名为ISAHESVAL-NL的创新分析流程。该方法通过整合纳米孔长读长测序与全基因组数据，利用等位基因信息性单核苷酸变异（allele-informative SNVs）将转录本reads分配到特定等位基因，结合FLAIR（Full-Length Alternative Isoform analysis of RNA）算法，实现了单样本内剪接变体功能效应的系统性评估。

关键技术包括：1）基于SpliceAI（delta score≥0.5）和snpEff预测杂合剪接变体；2）利用纳米孔直接RNA测序（direct RNA sequencing）和5'端帽捕获全长cDNA测序（CTR-seq）获取全长转录本；3）通过whatshap进行单倍型分型；4）采用CRISPR/Cas9靶向富集解决低丰度转录本检测难题。研究纳入GM12878细胞系、3例临床样本（含McArdle病患者）进行验证。

主要研究结果

等位基因特异性异构体评估的简明流程

开发的双阶段分析流程首先通过等位基因信息性SNVs分离纳米孔长读长数据，随后采用FLAIR进行异构体定量。在GM12878细胞中，从401个预测变体中鉴定出14个具有显著等位基因差异的剪接变体（Bonferroni校正p<0.05），包括已知等位基因特异性表达的IFIH1和MMAB基因。

纳米孔直接RNA测序的等位基因水平异构体评估

在癌症细胞系K562和HepG2中，发现GIPC1、RIPK2等肿瘤相关基因的剪接变体导致等位基因间异构体组成差异，证实方法在肿瘤研究中的适用性。

全长纳米孔cDNA转录组的等位基因水平分析

临床样本CTR-seq数据显示，健康对照者中BTN3A2基因chr6:26368051G>A变体导致相邻外显子跳跃，而McArdle病患者BST1基因chr4:15722935G>A变体引发相似效应，证明方法在临床样本中的敏感性。

PYGM等位基因特异性异常异构体表达

针对McArdle病患者（携带PYGM c.1519-3T>G新发剪接变体），纳米孔cDNA扩增子测序揭示等位基因特异性异常：变异等位基因产生外显子13跳跃（22.3%）、内含子12保留（7.9%）等异构体，经AlphaFold2预测导致蛋白结构域缺失。

该研究首次建立了个体化评估剪接变体功能的标准化流程，突破了传统方法对对照样本的依赖。通过整合多组学数据和创新生物信息学方法，为罕见病诊断和精准医疗提供了新范式。特别值得注意的是，该方法在仅需ng级RNA样本的情况下，即可实现致病性剪接变体的功能验证，这对临床样本稀缺的罕见病研究具有重要价值。未来随着纳米孔Q20+等高性能测序化学的发展，该方法在灵敏度和准确性上还有更大提升空间。