鸡源miR-363-5p通过靶向CPEB2调控MAPK/ERK信号通路在肝脏疾病中的作用机制及三种禽呼吸道病原体多重qPCR检测技术的建立

针对禽类呼吸道病原体（MG、MS、APG）临床鉴别诊断困难的问题，南京农业大学团队通过比较基因组学筛选出APG特异性基因K5O18_RS13655，结合MG的mgc2和MS的VY93_RS02250靶点，建立了一套灵敏度达5-10拷贝/反应、变异系数<2%的单重/多重qPCR检测体系。该研究为禽类三种高致病性病原体的同步监测提供了高效技术方案。

　　

禽类呼吸道疾病是困扰全球养殖业的重大难题，其中鸡毒支原体（MG）、滑液囊支原体（MS）和副鸡禽杆菌（APG）这三种病原体尤为棘手。它们不仅临床症状高度相似——都会导致呼吸道症状、生长迟缓和产蛋下降，更麻烦的是传统分离培养方法耗时费力，往往需要2-3周才能获得结果。更糟糕的是，这些病原体经常混合感染，据印度和中国的流行病学调查显示，MG和MS的共感染率分别高达70.67%和45.60%。而现有检测技术要么无法区分这三种病原体，要么需要多次独立检测，既费时又增加了检测成本。

南京农业大学兽医学院的研究团队在《Poultry Science》发表的研究中，通过创新性的技术路线解决了这一难题。他们首先运用生物信息学手段，从16株APG全基因组中筛选出6个特异性基因，最终选定位于基因组稳定区域的K5O18_RS13655（编码自转运蛋白）作为检测靶点。结合团队前期发现的MS特异性基因VY93_RS02250，以及优化后的MG检测靶点mgc2，建立了一套"模块化"qPCR检测体系。

关键技术包括：1）采用CD-HIT聚类和BLAST比对筛选特异性基因；2）使用Vazyme公司的探针法qPCR试剂优化反应体系；3）构建1×10¹-10⁹拷贝/反应的标准质粒评估灵敏度；4）用12种禽病原体核酸验证特异性；5）对276份临床样本进行方法学验证。

【APG特异性功能基因的鉴定】

通过比较16株APG与16株近缘菌的15,310个基因簇，锁定77个APG特有基因簇。经BLAST验证，K5O18_RS13655在核酸水平仅与APG同源，且其基因组位置紧邻管家基因zwf（MLST分型标记），排除了基因水平转移干扰。

【检测靶点的确定】

APG靶点K5O18_RS13655与MG的mgc2、MS的VY93_RS02250均设计TaqMan探针，其中MG探针与近缘种M. tullyi存在5个SNP差异，显著优于OIE手册推荐方法（仅1个SNP差异）。

【标准曲线的建立】

单重qPCR检测APG时，扩增效率达92.81%（R²=0.9999），三重qPCR中APG通道的100%检出限为10拷贝/反应（5拷贝时检出率80%），MG/MS通道均保持5拷贝/反应的灵敏度。

【特异性与重复性】

所有方法均仅对目标病原体产生信号，包括与APG近缘的Avibacterium volantium等菌株。组内和组间变异系数分别控制在0.14-1.95%和0.10-1.98%，临床样本检测符合率达100%。

这项研究的创新性体现在三个方面：首先，首次实现MG、MS、APG三种病原体的"一管三检"，检测成本降低60%以上；其次，APG新靶点K5O18_RS13655解决了传统HPG-2靶点与Pasteurella multocida等菌株的交叉反应问题；最后，模块化设计使实验室可根据需求灵活选择单重、双重或三重检测模式。

正如讨论部分指出，该技术已在中国276份临床样本中验证，检测出MG（70.65%）、MS（76.45%）和APG（56.88%）的高感染率。未来通过标准化采样和核酸提取流程，这套体系有望成为禽类呼吸道病原体监测的"金标准"，为养殖场制定精准防控策略提供关键技术支撑。研究团队特别强调，该方法对MG mgc2突变株（意大利流行株）的检测能力，弥补了OIE现行方法的缺陷。