AlphaFold3引导的单氨基酸替换创制十字花科病原菌双功能选择标记：兼具除草剂抗性与遗传标签

本研究针对十字花科病原真菌Colletotrichum higginsianum基因组编辑工具匮乏的现状，通过AlphaFold3结构预测指导ALS酶单点突变（A200D），成功开发出兼具除草剂氯嘧磺隆（CE）抗性与遗传标记功能的双功能系统。该研究不仅解决了真菌遗传操作选择标记稀缺的难题，还为病原菌进化防控提供了分子警示。

　　

在十字花科作物病害防治领域，Colletotrichum higginsianum引发的炭疽病长期威胁着全球蔬菜生产。然而，研究该病原菌致病机制的遗传工具却面临严峻挑战——传统选择标记如抗生素抗性基因存在物种适用性局限，且外源基因的引入可能干扰病原菌天然致病过程。更棘手的是，真菌内源选择标记资源稀缺，严重制约了精准基因编辑技术的应用。与此同时，农业生产中广泛使用的除草剂氯嘧磺隆（chlorimuron ethyl, CE）通过靶向乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase, ALS）发挥作用，但病原菌可能通过ALS突变产生抗药性的进化风险尚未系统评估。

针对这些关键问题，华南农业大学植物保护学院/广东省微生物信号与病害控制重点实验室的研究团队开展了一项创新研究。他们巧妙地将AlphaFold3人工智能结构预测、蛋白质理性设计与病原菌遗传操作系统开发相结合，成功将ALS酶改造为兼具选择压力抗性和遗传标记功能的双功能工具。这项突破性成果发表在《Journal of Integrative Agriculture》上，为植物病原真菌研究提供了全新解决方案。

研究团队主要采用AlphaFold3三维结构预测确定ALS关键功能域，通过分子对接模拟筛选潜在突变位点，利用同源重组技术构建A200D突变体，并采用激光共聚焦显微镜验证亚细胞定位标记效果。在广东菜心（Brassica parachinensis）上完成致病力评估，确保遗传改造不影响病原菌生物学特性。

研究结果

AlphaFold3结构预测揭示ALS保守域

通过AlphaFold3预测获得ChALS高精度三维结构，发现V191、A200、F201等疏水氨基酸构成CE结合口袋。结构比对显示这些位点在真菌ALS中高度保守，为靶向改造提供理论依据。

A200D突变赋予CE抗性

将第200位丙氨酸突变为天冬氨酸（A200D）后，CE半数抑制浓度提高38倍。分子动力学模拟显示，突变引入的羧酸基团与CE苯环产生空间位阻，解离常数增加5.7倍，而BCAA合成活性保持不变。

双功能标记系统构建

以A200D作为选择标记，在ALS基因位点精准整合eGFP、mCherry等报告基因，成功实现细胞核、线粒体等亚细胞器标记。突变菌株在无选择压力下传代15代仍保持标记稳定性。

致病力验证

改造菌株在寄主植物上的侵染动力学与野生型无显著差异，附着胞形成率（92.3±4.1% vs 94.7±3.8%）和病斑扩展速度（1.28±0.15 mm/day vs 1.31±0.13 mm/day）均未受影响，证实遗传操作未改变病原菌基本特性。

该研究首次实现单氨基酸突变同时满足选择压力和遗传标记双重需求，突破了真菌基因编辑工具匮乏的瓶颈。所开发的A200D标记系统具有内源性强、稳定性高、兼容多种报告基因等优势，为研究病原菌与寄主互作提供了可视化工具。更重要的是，研究揭示ALS单点突变即可产生显著抗药性，这对依赖单靶点抑制剂的病害防控策略提出警示——病原菌可能通过简单突变逃逸化学防治，提示未来应开发多靶点协同作用的新型农药。这项成果不仅推进了植物病理学研究方法学，也为农业抗药性治理提供了重要理论依据。