寡组氨酸功能化的单壁碳纳米管引导RNA传递技术，用于提高植物愈伤组织中茎的再生效率

《Advanced Functional Materials》：Oligohistidine-Functionalized Single-Walled Carbon Nanotube-Guided RNA Delivery to Improve Shoot Regeneration Efficiency in Plant Calli

植物组织培养效率受内在遗传屏障限制，本研究通过单壁碳纳米管（SWNTs）表面修饰His6肽形成纳米载体（His6-SWNT），实现靶向递送短串联模拟RNA（STTM396），抑制抑制 shoot regeneration的miR396，促进GRF基因表达，使Arabidopsis和番茄 callus的 shoot再生效率提升约2倍。该pH响应型纳米载体可稳定保护RNA并实现胞内释放，为突破作物再生瓶颈提供新策略。

　　植物组织培养在遗传工程和生物技术领域扮演着核心角色，然而其效率一直受到内在遗传屏障的限制。为了解决这一问题，研究团队提出了一种创新方法，利用单壁碳纳米管（SWNTs）修饰有六聚组氨酸肽（His?-SWNT），以实现靶向RNA递送，从而提高植物愈伤组织再生能力。该方法通过增强pH敏感性和在细胞质环境中实现对核酸的控制释放，使得RNA能够在不破坏植物细胞的情况下有效传递。通过将短串联靶向模仿RNA（STTM396）递送至愈伤组织，可以抑制miR396，这是一种已知的抑制芽再生的遗传屏障。结果表明，使用STTM396-SWNT处理能够使植物的芽再生效率提升约两倍，这对于许多再生困难的作物种类具有重要意义。

### 植物组织培养的重要性

植物组织培养技术自1902年由Gottlieb Haberlandt首次提出以来，已经广泛应用于引入新性状和开发新植物品种。随着全球人口的迅速增长和全球变暖带来的挑战，提高植物生长和产量成为迫切需求。此外，培育能够适应不断变化的气候条件的植物品种也变得尤为重要。植物遗传工程依赖于组织培养系统，而这一系统的效率对于植物生物技术的发展至关重要。尽管已有多种化学和激素处理方法提升了组织培养效率，但植物细胞和组织的再生能力仍然受到遗传因素的限制。

### 内在遗传屏障

研究表明，许多植物物种在组织培养过程中遇到的再生效率瓶颈并非源于外部培养条件，而是由于内在的遗传屏障。这些屏障通常涉及基因表达调控，尤其是在细胞获得多能性及新生器官形成的关键阶段。miR396作为一种遗传屏障，通过与GRF基因的mRNA结合，抑制其表达，从而限制芽再生。因此，抑制miR396可能是一种有效的方法，以提升植物再生效率。然而，传统的基因材料递送方法，如农杆菌介导的转化和粒子轰击，难以实现miR396的暂时性抑制，因为它们需要永久性的基因整合。

### 单壁碳纳米管的优势

单壁碳纳米管（SWNTs）作为一种新型的纳米载体，具有独特的物理和化学特性，使其成为植物组织培养中RNA递送的理想选择。SWNTs具有生物相容性，且其高长径比（约为300–1000）和直径（约1纳米）使其能够高效负载和递送生物分子。此外，SWNTs的机械强度极高，其杨氏模量可达0.64–1太帕斯卡，这使得它们能够轻松穿透植物细胞壁。在细胞质环境中，SWNTs能够保护其携带的RNA分子，使其免受细胞代谢和降解的影响。SWNTs可以通过非共价和共价结合在表面进行功能化修饰，从而实现对特定生物分子的定制化递送。这种特性使得SWNTs在植物生物技术中的应用成为可能。

### His?-SWNT的功能化设计

为了解决传统SWNTs在中性pH条件下释放RNA的效率问题，研究团队设计了一种新型的SWNTs载体，即His?-SWNT。该载体通过将寡组氨酸肽（His?）与SWNTs结合，利用其pH敏感性，在细胞质环境中实现对RNA的高效释放。His?肽的咪唑基团在pH值低于6时呈正电荷，而在pH值高于7时则会去质子化，从而减少与RNA的静电相互作用，实现RNA的释放。这种设计使得His?-SWNT能够在中性pH的细胞质中释放RNA，而不会影响细胞的正常生理功能。

### STTM396的设计与功能

STTM396是一种人工设计的非编码RNA，其通过互补碱基配对来捕获和阻断目标小RNA的功能。由于miR396是芽再生的遗传屏障，因此STTM396被设计用于特异性抑制miR396。通过将STTM396与His?-SWNT结合，可以实现对miR396的有效抑制，从而促进GRF基因的表达。GRF基因是芽再生的关键驱动因子，其表达水平的提高有助于提升再生效率。

### 实验结果

在实验中，研究团队发现His?-SWNT在中性pH条件下能够释放约34.8%的RNA载荷，而在高盐浓度的细胞质环境中，释放效率进一步提升至45.8%。这表明His?-SWNT能够有效保护RNA免受RNase A等酶的降解，从而确保其在细胞内的稳定性和功能。此外，通过荧光共聚焦显微镜和拉曼光谱分析，研究人员确认了His?-SWNT能够穿透愈伤组织，并在细胞质中释放RNA。在拟南芥和番茄的愈伤组织中，STTM396–SWNT处理显著提升了芽再生效率，分别达到了约两倍和两倍的效果。

### 应用前景

这一研究不仅展示了His?-SWNT作为纳米载体在植物组织培养中的潜力，还提出了一个实际可行的平台，用于克服遗传障碍，提高再生效率。这一技术特别适用于那些难以通过传统方法进行基因转化的作物种类，如小麦、水稻、柑橘和葡萄等。通过靶向、暂时性的RNA递送，这一方法能够有效调控基因表达，从而提升植物再生效率，促进植物生物技术和遗传工程的发展。此外，该技术的可扩展性意味着它可能在未来应用于更多植物种类，特别是在再生效率较低的作物中，为可持续农业提供新的解决方案。