苹果MdPOB1L通过调控MdNPR1蛋白稳定性正调控对葡萄座腔菌的抗病性

这篇研究揭示了苹果BTB-BACK型E3泛素连接酶MdPOB1L通过促进SA信号通路核心调控因子MdNPR1的泛素化降解，正调控苹果对Botryosphaeria dothidea（葡萄座腔菌）的抗病性机制。研究结合转基因苹果愈伤组织和果实实验证明，MdPOB1L能显著激活SA响应基因（PRs）表达并提升防御酶（β-1,3-葡聚糖酶/几丁质酶）活性，为果树抗病育种提供了新靶点。

　　

1 引言

苹果轮纹病由半活体营养型真菌Botryosphaeria dothidea（B. dothidea）引发，严重影响果实品质。植物通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)精细调控免疫反应，其中E3泛素连接酶通过特异性识别底物蛋白参与该过程。前人研究发现POZ/BTB蛋白家族成员如AtPOB1、NbPOB1多表现为抗病负调控因子，但苹果中同源蛋白MdPOB1L的功能尚不明确。

2.1 生物信息学分析

MdPOB1L（MD14G1117700）与西洋梨PbPOB1同源性最高（62.83%），含有保守的BTB-BACK结构域。系统发育分析显示其与蔷薇科植物（桃、梅等）POB1类蛋白聚于同一进化分支。

2.2 亚细胞定位与诱导表达

激光共聚焦观察显示MdPOB1L-eGFP信号与DAPI染色的细胞核重合，证实其核定位特性。qPCR分析发现B. dothidea侵染72小时后MdPOB1L表达量达峰值（13倍），100 μM水杨酸(SA)处理3小时后表达上调4倍，暗示其参与SA介导的抗病响应。

2.3 转基因愈伤组织抗病表型

过表达MdPOB1L的苹果愈伤组织（OX-6/10/11）接种B. dothidea后病斑面积较野生型(Orin)减少40-60%，而反义抑制株系(Anti-3/6/8)病斑扩大1.5倍。OX株系中SA响应基因MdPR2/MdPR8表达量提升2-3倍，防御酶β-1,3-葡聚糖酶活性增加80%，H₂O₂积累量提高50%。

2.4 果实瞬时转化验证

富士苹果果实瞬时过表达MdPOB1L后，病斑面积缩小35%，同时MdNPR1转录水平提升2.2倍；而病毒诱导基因沉默(TRV-MdPOB1L)组别中O₂^-生成速率降低40%，证实MdPOB1L通过ROS爆发增强抗性。

2.5 蛋白互作机制

酵母双杂交(Y2H)筛选发现MdNPR1与MdPOB1L特异性结合，而与其同源蛋白MdPOB1无互作。双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)证实互作发生于细胞核，且MdNPR1的NPR1结构域为关键互作区域。

2.6 泛素化降解途径

体外降解实验显示：MdPOB1L-OX愈伤组织蛋白提取物中MdNPR1-His半衰期缩短至1小时（野生型为3小时），而添加蛋白酶体抑制剂MG132后降解被抑制。体内泛素化检测发现MdNPR1-MYC/MdPOB1L-GFP双转基因系中多聚泛素化MdNPR1含量增加3倍。

3 讨论

本研究首次报道BTB-BACK型E3连接酶正向调控植物免疫的机制：MdPOB1L通过促进MdNPR1的核内周转，加速SA信号通路的激活周期。与同家族蛋白MdPOB1（靶向降解MdPUB29负调抗性）不同，MdPOB1L-MdNPR1模块通过"促降解-再激活"循环增强PR基因表达，这种功能分化可能与启动子区差异响应元件相关。该发现为设计基于UPS的果树病害防控策略提供了新视角。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容；专业术语如SA/NPR1/PR等均按原文格式标注；上标下标采用^{/_{标签规范呈现）}}