柑橘绿斑矮化相关病毒RepA蛋白通过抑制柠檬苹果酸脱氢酶诱导的叶绿体核周聚集调控宿主防御反应

这篇研究揭示了柑橘绿斑矮化相关病毒（CCDaV）的复制相关蛋白A（RepA）与宿主柠檬（Citrus limon）叶绿体苹果酸脱氢酶（ClMDH）的互作机制。研究发现ClMDH通过诱导叶绿体核周聚集（PCC）参与宿主防御，而RepA通过核定位劫持ClMDH并破坏PCC形成，同时抑制活性氧（ROS）爆发和过敏反应（HR）样细胞死亡，促进病毒积累。该研究为柑橘抗病毒育种提供了新靶点。

　　

1 引言

柑橘绿斑矮化相关病毒（CCDaV）是近年来新发现的单链环状DNA病毒，属于双生病毒科（Geminiviridae），可导致柑橘叶片斑驳、皱缩等症状，对柠檬和柚类危害尤为严重。其复制相关蛋白A（RepA）能触发宿主过敏反应（HR）样细胞死亡和活性氧（ROS）爆发，但具体机制尚不明确。叶绿体作为植物抗病毒防御的重要细胞器，其动态变化如叶绿体核周聚集（PCC）与病毒侵染密切相关。苹果酸脱氢酶（MDH）是参与光合作用和氧化还原平衡的关键酶，但其在病毒互作中的作用未见报道。

2 结果

2.1 筛选RepA互作蛋白

通过酵母双杂交（Y2H）从柠檬cDNA文库中筛选出39.34%的叶绿体相关蛋白，包括叶绿体苹果酸脱氢酶（ClMDH），其与甜橙plNAD-MDH（XM_015529903.3）相似度达99.6%。

2.2 RepA与ClMDH互作验证

Y2H、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）证实RepA与ClMDH在核内互作。截断实验显示ClMDH的42-412氨基酸区域为互作关键区，而N端1-41氨基酸为叶绿体定位信号肽。

2.5 ClMDH表达模式

在抗病品种甜橙中，ClMDH在幼叶的表达量显著高于感病品种柠檬。CCDaV侵染后，柠檬中ClMDH表达下调26.61%。

2.6 ClMDH诱导PCC的机制

ClMDH定位于叶绿体并诱导PCC和基质管（stromules）形成。截断突变体表明：1-93氨基酸负责叶绿体定位和PCC诱导，而Ldh_1_C结构域（239-405 aa）调控基质管形成。

2.7 ClMDH调控防御反应

ClMDH过表达虽增加ROS积累，但能抑制RepA触发的HR样坏死，同时下调SA通路基因（NbPR1/NbPR2）表达。

2.8 病毒对宿主因子的劫持

RepA通过核定位将ClMDH从叶绿体招募至细胞核，破坏PCC形成，并促进自身积累。在柠檬中过表达ClMDH使病毒外壳蛋白（CP）转录水平提高1.77倍，而沉默ClMDH则降低CP表达37.84%。

3 讨论

本研究首次揭示CCDaV通过RepA-ClMDH互作劫持宿主防御枢纽：

1. ClMDH诱导的PCC可能通过物理屏障限制病毒移动，但病毒通过核定位ClMDH反制该防御；

2. RepA抑制ClMDH介导的ROS爆发，创造利于病毒复制的氧化还原环境；

3. 抗病品种甜橙中高基础ClMDH表达提示其可能通过多途径协同抗病。

4 实验方法

研究采用Y2H、BiFC、Co-IP等技术验证蛋白互作；通过农杆菌（Agrobacterium）介导的瞬时表达分析亚细胞定位；利用病毒诱导基因沉默（VIGS）和DAB染色分别验证基因功能与ROS积累。

该发现为理解双生病毒与宿主的“军备竞赛”提供了新视角，ClMDH可作为抗病育种的潜在编辑靶点。未来需进一步解析PCC在柑橘抗病毒中的精确调控网络。