粪便DNA二代测序技术揭示雪豹线粒体基因组谱系地理新格局

本研究通过二代测序（NGS）技术对青藏高原东部19份雪豹粪便样本进行线粒体基因组（mitogenome）测序，成功组装17条全长序列（约16,720 bp），鉴定出67个SNP位点。研究首次发现雪豹存在南北分化的两大mtDNA谱系（谱系距离0.31%），其分化程度与狮虎主要亚种相当，为雪豹保护遗传学研究提供了突破性技术方案和重要理论基础。

　　

摘要

粪便样本因其非侵入特性成为雪豹（Panthera uncia）等濒危物种遗传研究的理想材料。本研究突破传统PCR技术局限，采用二代测序（NGS）对19份青藏高原东部粪便样本进行全基因组测序，每个样本获得6.51–12.72 Gb原始数据。成功组装的17条完整线粒体基因组揭示出两个显著分化的mtDNA谱系：一支集中分布于祁连山，另一支广布于三江源和横断山区。

方法学突破

针对粪便DNA含量低、降解严重的特点，研究团队优化了NGS建库流程：取消超声破碎步骤以避免DNA过度片段化，采用低灵敏度快速映射策略，以参考基因组KP202269为模板进行序列组装。样本平均插入片段长度244–349 bp，测序深度7.2–3500.2×，mtDNA序列产出效率最高达432.95×/Gb。两个样本因核线粒体假基因（Numt）干扰被排除，凸显了粪便样本的特殊挑战。

关键发现

在15,419 bp编码区序列分析中，雪豹两大谱系呈现0.31%的遗传距离，相当于：

• 狮亚种间差异（0.38–0.82%）

• 虎亚种间差异（0.24–0.56%）

  超变区I（15,756–15,890 bp）和ATP6/COX3基因连接区（8622–8717 bp）被鉴定为SNP富集区域，而前人研究的683 bp短片段仅检测到2个变异位点，证实全基因组测序的必要性。

谱系地理格局

系统发育分析显示：

1. 谱系A：占样本量的65%（11/17），广布三江源和横断山区

2. 谱系B：集中分布于祁连山，但在三江源西北边缘（青海玛沁）存在同域分布

   意外的是，蒙古样本 basal 位置归属于谱系A，暗示该谱系可能跨区域分布。与最新群体基因组研究（Yang et al. 2025）对比发现，这种mtDNA南北分化模式与核基因组弱分化形成鲜明对比，可能反映历史雌性谱系隔离与近期雄性偏扩散的混合效应。

技术应用前景

研究建立的"宏基因组略读"（metagenome skimming）策略具有显著优势：

• 成本效益：4Gb数据量即可满足79%样本的20×覆盖要求

• 标准化程度：兼容商业测序服务，促进全球数据共享

  推荐将ATP6/COX3连接区、ND4基因和超变区I作为PCR研究的优先靶标，为大规模种群调查提供折衷方案。

保护启示

青藏高原东部雪豹的局域尺度遗传多样性远超既往认知，建议：

1. 将祁连山种群作为独立管理单元

2. 加强三江源-横断山走廊带栖息地连通性

3. 建立跨国界样本和数据共享机制

这项研究为理解雪豹演化历史提供了新视角，其技术路线可推广至其他濒危物种的非损伤性遗传研究，对全球生物多样性保护具有示范意义。