番茄PUB21基因突变赋予对坏死性真菌抗性的机制研究

本研究针对番茄易感坏死性真菌Botrytis cinerea和Alternaria solani的难题，通过EMS诱变筛选发现PUB21基因突变可显著降低宿主易感性。研究人员采用RNAi沉默和CRISPR编辑技术验证了PUB21作为易感基因(S-gene)的功能，首次揭示番茄U-box E3泛素连接酶PUB17与PUB21在程序性细胞死亡(PCD)通路中的协同作用，为抗病育种提供了新靶点。该成果发表于《BMC Plant Biology》。

　　

番茄作为全球重要经济作物，长期受到坏死性真菌Botrytis cinerea和Alternaria solani的严重威胁。这些病原体能感染1400多种植物，通过分泌细胞死亡诱导蛋白(CDIPs)和操纵宿主自噬-凋亡平衡实现侵染。传统育种中，虽然从野生番茄中发现了多个数量性状位点(QTL)，但始终未能获得与野生种相当的抗性水平。更棘手的是，植物易感基因(S-gene)往往参与重要生理过程，简单敲除可能导致植株发育缺陷。这种两难境地促使科学家寻找既能增强抗性又不影响植株正常生长的基因靶点。

荷兰瓦赫宁根大学(Wageningen University & Research)的研究团队在《BMC Plant Biology》发表突破性研究。他们通过对Micro-Tom EMS突变体库的筛选，意外发现一个比已知pub17突变体抗性更强的株系。通过全基因组测序(WGS)和批量分离分析(BSA)，鉴定出番茄PUB21(Solyc11g006030)基因的T→A突变导致第297位亮氨酸提前终止。该基因编码含ARM重复结构域的U-box E3泛素连接酶，与拟南芥AtPUB21/CMPG5高度同源。研究人员运用RNAi沉默和CRISPR/Cas9编辑技术，在栽培品种Moneymaker中证实PUB21功能缺失可显著降低对两种真菌的易感性，且与PUB17突变呈现抗性叠加效应。

关键技术包括：1)利用EMS诱变创建番茄突变体库；2)基于全基因组测序的BSA分析定位突变位点；3)设计特异性RNAi片段(靶向U-box与ARM结构域间区或ARM重复区)进行基因沉默；4)采用三sgRNA的CRISPR/Cas9系统进行基因编辑；5)标准化离体叶片接种法(DLA)评估抗性表型。

研究结果显示：

【Botrytis抗性在单pub17、单pub21和双pub17/pub21突变体中的表现】通过F₂群体分离分析，发现单pub21突变体的平均病斑直径与单pub17相当，而双突变体抗性显著增强。这表明两个基因通过不同途径影响抗性。

【PUB21 RNAi沉默导致对B.cinerea抗性增强】两个RNAi构建靶向不同结构域，其中TV202218和TV202241株系在接种45小时后完全抑制了病原诱导的PUB21表达上调，病斑减小24-27%。

【CRISPR突变对PUB21蛋白结构的影响】sgRNA1诱导的4-bp缺失(等位基因1)和1-bp插入(等位基因2)均导致U-box结构域截短和ARM重复完全缺失，证实ARM结构域的完整性对真菌易感性至关重要。

【PUB21突变体对其他病原体的敏感性】值得注意的是，pub21突变对专性寄生的Pseudoidium neolycopersici无效，表明其抗性具有病原特异性。

讨论部分揭示了三个重要发现：首先，番茄PUB21与拟南芥同源基因功能分化，可能通过调节程序性细胞死亡(PCD)平衡影响抗性——其突变导致的自发性坏死斑点提示该基因参与调控凋亡与自噬的平衡。其次，PUB21与PUB17在抗性中的叠加效应表明二者作用于不同PCD通路，这为设计多基因编辑策略提供了理论依据。最后，ARM重复结构域的缺失足以赋予抗性，为开发不影响U-box基本功能的靶向育种创造了可能。

该研究首次系统阐明了番茄PUB家族两个成员在抗坏死性真菌中的协同作用机制，创制的pub21突变体在保持植株基本活力的同时显著增强抗性，克服了传统S-gene编辑导致的生长缺陷问题。所建立的"双基因弱等位突变"策略为其他作物抗病育种提供了新思路，特别是针对缺乏显性抗性基因的病害体系。未来研究将聚焦于解析PUB21下游靶标蛋白，以揭示其在PCD调控网络中的精确位置。