利用牛津纳米孔长读长测序技术实现非洲猪瘟病毒基因组全长的发夹环至发夹环完整组装

这篇研究通过牛津纳米孔（ONT）长读长测序技术，首次实现了非洲猪瘟病毒（ASFV）Chonburi_2024_209-MA株的全长基因组组装，揭示了其发夹环（hairpin loop）和末端反向重复序列（ITR）的结构特征。研究克服了短读长测序在复杂重复区域的局限性，解析了病毒基因组末端的37核苷酸AT富集发夹环及其自发形成的稳定二级结构（自由能-24.83 kcal/mol），并发现细胞传代导致的MGF505基因簇C-to-T高频突变可能与APOBEC介导的宿主免疫编辑有关。该成果为ASFV基因组进化和疫苗研发提供了关键模板。

　　

1 引言

非洲猪瘟病毒（ASFV）作为引发猪致死性出血热的高度传染性病原体，其基因组结构复杂，包含约170-190 kb的线性双链DNA，两端具有反向末端重复序列（ITR）和发夹环结构。这些特殊结构导致传统短读长测序技术难以准确组装，目前仅有BA71V株通过桑格测序等技术完成末端解析。本研究利用牛津纳米孔长读长测序技术，对MA-104细胞传代50代的泰国Chonburi分离株进行全长组装，揭示了发夹环介导的测序数据特征及其生物学意义。

2 材料与方法

病毒分离自泰国春武里府的大型白猪，经MA-104细胞连续传代后，通过超速离心富集病毒颗粒并提取DNA。采用ONT MinION Mk1C平台进行长读长测序（平均读长5.9 kb，覆盖深度637×），结合MGI短读长数据（150 bp双端）进行校正。通过CANU软件组装后，利用mFold预测发夹环二级结构，并比较Georgia2007/1等参考基因组分析变异。

3 结果

3.1 纳米孔长读长组装特征

初步组装产生249.9 kb的环状序列，两端存在35 kb（5′端）和27 kb（3′端）的重复反向互补（DRC）区域，深度仅为核心区域的50%，提示发夹环导致的双链同步测序现象。比对分析发现4.7 kb的RVR区缺失，涉及MGF360-16R等9个基因。

3.2 发夹环结构验证

从DRC序列中心提取的37 nt AT富集序列（5′-ATATATATAAAATTATAAAGTATATTATATACTTATA-3′）可自发形成三环两茎的稳定结构（自由能-24.83 kcal/mol），与BA71V报道的发夹环拓扑差异源于侧翼序列的纳入。

3.3 全长基因组特征

最终组装版本（187.6 kb，GenBank PV339939）包含完整的ITR（2.2 kb）和发夹环，编码186个ORF。ITR区保留DP60R和ACD_01990基因，而短读长组装缺失末端23.5%序列。

3.4 比较基因组学

与Georgia2007/1相比，Chonburi株在MGF505-2R和MGF505-3R基因出现19和21个C-to-T高频突变（频率6.38%-12.14%），导致Gln93和Gln41提前终止。此外，MGF300-2R等4个基因因移码突变产生截短蛋白，可能与MA-104细胞适应性衰减相关。

4 讨论

本研究首次通过ONT实现了ASFV发夹环至发夹环的全长组装，揭示了DRC序列是发夹环连接双链经纳米孔测序的技术假象。MGF505基因的C-to-T突变模式暗示猪APOBEC3可能参与病毒基因组编辑，这一发现为理解宿主-病毒互作提供了新视角。传代导致的基因缺失与截断或解释病毒对猴肾细胞的适应机制，为减毒疫苗设计提供了分子靶点。该技术路线可推广至痘病毒等其他末端交联的DNA病毒基因组研究。