通过PEG介导的转化以及CRISPR/Cas9基因编辑技术对椰子原生质中的CnPDS基因进行改造

《Industrial Crops and Products》：PEG-mediated transformation and CRISPR/Cas9 gene editing of CnPDS in coconut protoplast

椰子原质体分离与CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立。通过优化酶浓度（3%纤维素酶+1.5%Macerozyme+2%Pectinase）、稳定剂体积（20mL）和消化时间（5小时），获得6.19×10?/g FW高活力原质体（存活率89.77%）。采用PEG介导转化，在0.4M CaCl?、40μg DNA、42℃热激1分钟条件下，转化效率达48.3%。通过Hi-TOM测序验证，成功在CnPDS基因位点实现4.02%的编辑效率。本研究首次建立椰子原质体基因编辑平台，为热带棕榈遗传改良提供新工具。

　　### 一、研究背景与意义

椰子（*Cocos nucifera*）是一种在热带地区广泛种植的重要经济作物和生态资源。它不仅在农业和食品行业中占据重要地位，还被广泛用于饮料、建筑材料以及制药、生物燃料等多个领域。椰子的多功能性使其成为全球数百万热带居民赖以生存的植物之一。在中国海南地区，椰子种植对当地的社会经济具有显著的贡献，不仅促进了食品生产和相关产业的收入增长，还通过其优美的树形为旅游业提供了重要支持。

然而，尽管椰子具有广泛的用途和重要的经济价值，其遗传改良仍面临诸多挑战。传统的育种方法在引入精确且目标性的性状方面存在局限性，而分子育种和基因组学技术的发展为椰子的改良提供了新的可能性。近年来，椰子基因组序列的发布为基因编辑技术的应用奠定了基础，使得研究人员能够针对椰子基因组进行精确的基因修饰。这一技术的进步不仅有助于功能基因组学研究，还可能彻底改变椰子产业的发展方式。

基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9系统，因其高效、灵活和易于操作的特点，在多种作物中得到了广泛应用。例如，该系统已被成功应用于油棕、小麦、西瓜、水稻、玉米等作物的基因组编辑。然而，对于椰子这一在体外再生方面较为困难的物种，目前尚未有有效的CRISPR/Cas9应用案例。因此，建立一种高效的椰子原生质体基因编辑系统具有重要的科学价值和应用前景。

### 二、研究方法与技术路径

本研究的主要目标是开发一种基于椰子原生质体的CRISPR/Cas9基因编辑系统，并优化原生质体的分离和PEG介导的转化过程。为了实现这一目标，研究团队首先从幼年椰子植株中分离出原生质体，并通过一系列实验优化了酶浓度、稳定溶液的体积以及消化时间等关键参数，以提高原生质体的产量和活力。在原生质体分离过程中，研究人员采用了梯度酶浓度的方法，通过测试不同的酶组合，最终确定了最佳的分离条件。

为了提高基因编辑的效率，研究团队还对PEG介导的转化方法进行了优化。PEG是一种常用的基因转化试剂，其作用是帮助外源DNA进入原生质体。在本研究中，研究人员测试了不同浓度的CaCl?对PEG转化效率的影响，并发现0.4?M CaCl?能够显著提高转化效率。此外，还优化了DNA浓度、热休克处理时间和转化后培养时间等参数，以进一步提升转化效果。通过这些优化措施，研究人员成功地实现了较高的基因转化效率，并且利用GFP作为分子标记，对转化后的原生质体进行了检测和分析。

在基因编辑方面，研究团队设计了针对椰子*PDS*基因的sgRNA，并构建了三种不同的CRISPR/Cas9载体：CnPDS-p15（适用于所有棕榈作物）、CnPDS-p13（椰子特异性）和CnPDS-v13（由企业开发用于商业化验证）。这些载体均包含不同的启动子，以调控Cas9和sgRNA的表达。通过PCR扩增和Hi-TOM高通量突变检测平台，研究人员评估了这些载体在椰子原生质体中的编辑效果，并发现CnPDS-p15载体在编辑效率方面表现最佳，达到了4.02%的编辑率。这一结果表明，基于原生质体的CRISPR/Cas9系统在椰子中具有一定的可行性，并为未来的基因编辑研究提供了新的方向。

### 三、研究结果与分析

在原生质体分离过程中，研究人员发现使用3%的纤维素酶、1.5%的果胶酶和2%的果胶酶组合，能够获得最高的原生质体产量（6.19 × 10?个/克鲜重）和活力（89.77%）。此外，稳定溶液的体积对原生质体的活力也有显著影响，当体积增加至20?mL时，原生质体的活力显著提高，达到了89.5%。这表明，通过优化稳定溶液的体积，可以有效提升原生质体的存活率，从而为后续的基因编辑实验提供更优质的材料。

在PEG介导的转化过程中，研究人员发现0.4?M CaCl?能够显著提高转化效率，达到48.3%。同时，通过调整DNA浓度、热休克时间和转化后培养时间，研究人员进一步优化了转化过程。其中，DNA浓度为40?μg时，转化效率最高，达到36.3%。热休克处理（42°C，1分钟）也显著提升了转化效率，增加了约5%。这些优化措施不仅提高了基因转化的成功率，还为椰子基因组的编辑提供了可靠的平台。

在基因编辑实验中，研究人员利用CnPDS-p15载体对椰子原生质体进行了编辑，并通过PCR和Hi-TOM平台检测了目标区域的突变情况。结果表明，该载体在椰子原生质体中成功诱导了*PDS*基因的突变，其中主要表现为GG的缺失，编辑效率为4.02%。这一结果虽然相对较低，但仍标志着CRISPR/Cas9技术在椰子基因组编辑中的首次应用。相比之下，椰子特异性载体（CnPDS-p13和CnPDS-v13）未能在目标位点诱导突变，这可能与sgRNA设计或Cas9表达效率有关。

### 四、讨论与启示

本研究中所建立的基于原生质体的基因编辑系统，为椰子的分子育种和基因功能研究提供了重要的工具。然而，该系统目前仍主要适用于瞬时表达实验，而稳定转化和植株再生仍是亟待解决的关键问题。椰子原生质体在体外再生方面的困难，限制了该系统在实际应用中的潜力。因此，未来的研究需要进一步优化再生条件，包括改善渗透压环境、筛选有效的生长调节剂以及利用单细胞转录组数据，以识别与全能性相关的关键调控因子。

此外，研究还发现，使用异源启动子（如2×CaMV 35S和AtU6–26）可能会影响基因编辑的效率。尽管这些启动子在其他植物中表现出良好的表达效果，但在椰子原生质体中，其表达水平可能不足以实现高效的基因编辑。因此，未来的研究应重点筛选椰子特异性的启动子，并优化sgRNA的设计，以提高编辑效率和突变多样性。

本研究的结果表明，椰子原生质体可以作为基因编辑和功能基因组学研究的有力工具。然而，该系统在实际应用中的局限性也显而易见。为了进一步提升椰子基因组编辑的效率，研究团队建议未来的工作应包括以下方面：1）筛选更高效的椰子内源启动子；2）优化sgRNA的设计，以提高其与目标基因的结合亲和力；3）探索更有效的基因编辑策略，例如DNA-free编辑技术；4）改进原生质体再生条件，以实现稳定转化和植株再生。这些研究方向将有助于推动椰子基因组编辑技术的发展，并为热带棕榈作物的遗传改良提供更广泛的应用前景。

### 五、结论与展望

综上所述，本研究成功建立了基于椰子原生质体的PEG介导转化和CRISPR/Cas9基因编辑系统，为椰子的分子育种和功能基因组学研究提供了新的方法。该系统不仅提高了原生质体的产量和活力，还实现了对*PDS*基因的编辑，尽管编辑效率相对较低，但这一成果为后续研究奠定了基础。此外，该系统还具有较高的应用价值，能够用于椰子及其他热带棕榈作物的基因功能研究和目标性状改良。

然而，该系统的应用仍受到原生质体再生效率的限制。因此，未来的研究应重点解决这一问题，通过优化再生条件，实现从原生质体到完整植株的稳定转化。同时，进一步提高基因编辑效率，探索椰子特异性启动子和sgRNA的组合，也将是提升该系统性能的重要方向。这些研究不仅有助于推动椰子基因组编辑技术的发展，还可能为其他热带作物的遗传改良提供参考和借鉴。

本研究的成果为椰子基因组编辑技术的进一步发展提供了重要的实验依据和理论支持。随着相关技术的不断进步，椰子这一重要的经济作物有望在基因组学和分子育种领域取得更大的突破。未来，随着更多研究的深入，椰子的遗传改良将变得更加精准和高效，为热带农业的可持续发展做出更大贡献。